Human associated genetic faecal markers for microbial water quality analysis: status quo of diagnostic qPCR techniques

Abstract

Die Überwachung der mikrobiologischen Wasserqualität und die Detektion von fäkalen Verunreinigungen spielt eine wichtige Rolle, da pathogene Mikroorganismen mittels fäkaler Einträgen in das Wasser gelangen können und Infektionen und Erkrankungen hervorrufen können. Fäkale Indikatorbakterien (FIB) wie zum Beispiel die Standardfäkalindikatoren Escherichia coli (E. coli) oder intestinale Enterokokken ermöglichen es, eine Aussage darüber zu treffen, ob fäkale Verunreinigungen vorliegen und wenn ja, wie stark die Verunreinigung ist. Der Ursprung der fäkalen Belastung kann jedoch nicht festgestellt werden. Aus diesem Grund erlangt die Methodik des "Microbial Source Trackings" (MST; Herkunftsbestimmung mikrobieller Kontaminationen) immer mehr an Bedeutung, da diese Verfahren die Möglichkeit bieten, den Ursprung einer fäkalen Verunreinigung im Wasser festzulegen (z.B. ob von Mensch oder Tier stammend). Dafür werden Wasserproben auf definierte bakterielle DNA-Abschnitte - die mit der fäkalen Eintragsquelle assoziiert sind - mit Hilfe einer quantitativen real-time PCR (qPCR) untersucht. Der Fokus dieser Arbeit liegt in der Etablierung und Evaluierung von human assoziierten "state-of-the-art" qPCR Verfahren. Zum einen handelt es sich um die Gruppe humaner mitochondrieller Zielgene (mtDNA), zum anderen um einen Vertreter der bakteriellen Bacteroidetes-Gruppe, den HF183II qPCR Assay von Green et al. (2014, Applied Environmental Microbiology, v. 80(10), p. 3086-3094). Bezüglich der humanen mtDNA wurde eine Literaturstudie durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Anwendung des mtDNA Analyseverfahrens ohne Konzentrierungsschritt der Gewässerproben nicht zielführend ist, da die Marker-Konzentrationen im Fäzes und Abwasser sehr gering sind. Für das HF183II qPCR Analyseverfahren wurde eine multiplex qPCR etabliert. Dafür wurden unterschiedliche fluoreszierende Reporterfarbstoffe und Primer verwendet, wodurch mehrere unterschiedliche DNA-Sequenzen simultan detektiert werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem eine interne Amplifikationskontrolle (IAC) als Qualitätskontrolle für das MST qPCR-Verfahren inkludiert. Die IAC dient als Kontrolle von falsch-negativen Ergebnissen. Das HF183II Analyseverfahren wurde mit zwei unterschied-lichen IAC's evaluiert. Einmal mit dem HF183II IAC Fragment von Green et al. (2014, Applied Environmental Microbiology, v. 80(10), p. 3086-3094), wobei das HF183II Fragment und das HF183II IAC Fragment um die gleichen Primer konkurrieren (d.h. kompetitive IAC) und einmal mit dem ntb2 IAC Fragment von Anderson et al. (2011, Food Analytical Methods, v. 4(3), p. 259-267), wobei das HF183II Fragment und das ntb2 IAC Fragment zwei unterschiedliche Primer benutzen (d.h. nicht-kompetitive IAC). Die Ergebnisse machten die Notwendigkeit des Einsatzes einer unabhängigen IAC als Qualitätskontrolle deutlich. Die Evaluierung des HF183II Analyseverfahrens erfolgte mit DNA-Extrakten aus Fäkalproben von Mensch, Tier und Kläranlagen. Des Weiteren wurde das etablierte und evaluierte Verfahren an ausgewählten DNA-Extrakten aus Wasserproben, die im Zuge der Joint Danube Survey 2013 (JDS3) an definierten Stellen in der Donau und ihren Zubringern genommen wurden, angewendet. Die Hypothese, dass menschliche fäkale Abwässer die dominante Rolle bei fäkalen Einträgen in die Donau spielen, wurde überprüft. Die Überprüfung wurde anhand des etablierten HF183II qPCR Analyseverfahren sowie anderer qPCR Verfahren, basierend auf AllBac, qPCR Enterococcus, BacHum, BacH, BacR und Pig2Bac, durchgeführt. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Etablierung des human assoziierten Analyseverfahrens HF813II erfolgreich war. Die Ergebnisse der JDS3 sind darüber hinaus gut vergleichbar mit denen der JDS1 (2001) und JDS2 (2007). Die Untersuchungen zeigen den großen Einfluss menschlicher Fäkaleinträge an den ausgewählten JDS3 Probenahmestellen für die Periode der JDS3. Dies unterstreicht die Nützlichkeit von qPCR MST Methoden in der Wasseranalytik.

The monitoring of the microbiological water quality and the detection of faecal contamination plays an essential role in order to prevent infection and disease by pathogenic organisms of faecal origin. Faecal indicator bacteria (FIB) like standard faecal indicator Eschericia coli (E. coli) or intestinal enterococci enables to quantify the existence of faecal contamination. However, the origin of faecal pollution cannot be detected. Thus, the importance of -Microbial Source Tracking- methods (MST) is increasing, since this approach offers the possibility to determine the origin of faecal contamination (e.g. whether from human or animal origin). This work focuses on the establishment and evaluation of human-associated "state-of-the-art" qPCR methods. First, the group of human mitochondrial target genes (mtDNA), and second, a representative of the bacterial Bacteroidetes-group, the qPCR assay HF183II of Green et al. (2014, Applied Environmental Microbiology, v. 80(10), p. 3086-3094), was evaluated. A literature research revealed, that the application of mtDNA analysis on water samples would not be possible without prior target-enrichment. This is because of the low target concentration in faeces and wastewater. Further experimental steps were thus not performed. In the case of the HF813II qPCR assay, a multiplex qPCR was established. Different fluorescent reporter dyes and primers were applied, enabling simultaneous DNA target-sequence detection. An internal amplification control (IAC), in order to monitor for false negative results in qPCR, was also established. The HF183II analysis procedure was evaluated by two different IAC's. On the one hand with the HF183II IAC fragment of Green et al. (2014, Applied Environmental Microbiology, v. 80(10), p. 3086-3094), in which the fragment of HF183II and the fragment of HF183II IAC compete for the same primers (competitive IAC). On the other hand it was evaluated with the ntb2 IAC fragment of Anderson et al. (2011, Food Analytical Methods, v. 4(3), p. 259-267), in which the HF183II fragment and the ntb2 IAC fragment use two different primers (non-competitive IAC). The results demonstrate the significance of applying a non-competitive IAC as a quality control. The evaluation of this HF183II assay was carried out with a DNA-extraction sample setup from samples from humans, animals and sewage of the Austrian region. Furthermore, the established qPCR assay was applied to selected DNA extracts from samples collected during the Joint Danube Survey 2013 (JDS3). Sampling was taken place at defined points in the Danube and its tributaries. The hypothesis, that human-associated faecal contamination in the Danube, due to the influence of municipal sewage disposal and wastewater, plays a dominating role was reviewed. The was realized by applying the established HF183II qPCR assay and other qPCR approaches including the AllBac, qPCR Enterococcus, BacHum, BacH, BacR and Pig2Bac assay. In summary, it can be concluded that the establishment and evaluation of the human-associated HF813II assay was successful. In addition, the results of JDS3 compare well with those gained from JDS1 (2001) and JDS2 (2007). The investigations of the selected samples from JDS3 sampling points indicate that human-associated faecal contamination in the Danube and its tributaries was of major importance for microbial feacal pollution during the JDSIII investigation period. This again underlines the usefulness of state-of-the-art qPCR-based genetic faecal marker quantification in water quality analysis.