Etablierung von HPLC-MS/MS-Methoden zur Bestimmung von Amphenicolen in Milch und Milchprodukten

Abstract

Amphenicole sind Breitbandantibiotika, deren Einsatz für die Tierzucht durch die Europäische Union geregelt und die Rückstandshöchstmengen in Lebensmitteln tierischen Ursprungs in der Verordnung (EU) Nr. 37/2010 festgelegt sind. Chloramphenicol ist verboten und Florfenicol, Florfenicolamin sowie Thiamphenicol unterliegen einem vorgeschriebenen Grenzwert. Jedoch ist die Anwendung von Florfenicol und Florfenicolamin nicht gestattet, wenn die Milch für den menschlichen Verzehr vorgesehen ist. In dieser Diplomarbeit wurde eine Methode auf Grundlage der Normmethode BVL L 06.00-60 - Bestimmung von Amphenicol-Rückständen in Muskel und Milch (HPLC-MS/MS-Verfahren) - für die Routineanalytik für Milch und Milchprodukte etabliert. Da jedoch diese Methode sehr zeitaufwändig ist, wurde noch eine Schnellmethode entwickelt. Als Bestimmungsgrenze wurde für Chloramphenicol, Florfenicol und Florfenicolamin 0.1 mg/kg und für Thiamphenicol 10 mg/kg angestrebt und auch erreicht. Für Florfenicolamin konnte jedoch diese Empfindlichkeit nicht erreicht werden. Bei der etablierten Methode wird die Probe nach Zugabe der isotopenmarkierten Amphenicol-Standards und einem Enzym hydrolisiert, mit Ethylacetat extrahiert und zentrifugiert. Die obere Phase wird entnommen und am Rotavapor bis zur Trockene abrotiert. Der Rückstand wird entfettet und mit mobiler Phase extrahiert. Die wässrige Phase wird membranfiltriert und der Messung mittels HPLC-MS/MS zugeführt. Bei der Schnellmethode werden der Probe die isotopenmarkierten Amphenicol-Standards und ein Enzym zugesetzt, hydrolisiert, zentrifugiert, membranfiltriert und mittels HPLC-MS/MS gemessen. Der Nachteil der Schnellmethode liegt darin, dass das Enzym die HPLC-Säule sehr schnell belegt. Die in dieser Diplomarbeit etablierte Methode hat den Vorteil, dass durch die Verkürzung der Laufzeit doppelt so viele Proben analysiert werden können. Die Wiederfindungsraten für die Methode wurden anhand der Validierung ermittelt. Für Chloramphenicol liegt die Wiederfindungsrate zwischen 85.6 % und 90.0 %, für Florfenicol zwischen 90.1 % und 93.6 % und für Thiamphenicol zwischen 91.1 % und 93.9 %. Die Methode ist akkreditiert und es wurde bereits bei einem internationalen Ringversuch für die Bestimmung von Chloramphenicol in Milch teilgenommen, der positiv absolviert wurde. Vorausschauend ist zu sagen, dass die Methode mit anderen Matrices erweitert und Florfenicolamin bei Vorliegen höherer Rückstandshöchstmengen mit analysiert werden kann.

Amphenicols are broad-spectrum antibiotics. In animal breeding, their use is regulated by the European Union and the maximum residue limits (MRL) in foodstuffs of animal origin are defined in the Commission Regulation (EU) No 37/2010. Chloramphenicol is banned. Florfenicol, florfenicol amine and thiamphenicol are subject to a legally defined limit. However, if the milk is provided for human consumption the administration of florfenicol and florfenicol amine are not allowed. In this diploma thesis a method based on the standard method BVL L 06.00-60 - Determination of amphenicols residues in muscle and milk (HPLC-MS/MS-method) - for the routine analysis for milk and milk products should be established. The standard method is time-consuming and so a rapid method has also been developed. The target determination limits of 0.1 mg/kg for chloramphenicol, florfenicol and florfenicol amine and of 10 mg/kg for thiamphenicol were aimed for and could be reached. Only the sensitivity of the determination of florfenicol amine could not be achieved. In the established method the sample is hydrolysed after addition of the isotope-labeled amphenicol-standards and an enzym. After the extraction with ethyl acetate the sample is centrifuged. The upper phase is removed and is evaporated to dryness in a rotary evaporator. The residuum is defatted and extracted with a mobile phase. The aqueous phase is filtered through a membrane and analysed by HPLC-MS/MS. A rapid method was established whereby the isotope-labeled amphenicol-standards and an enzym are added to the sample which subsequently was hydrolyzed, centrifuged, filtered through a membrane and analysed by HPLC-MS/MS. The disadvantage of the rapid method is that the HPLC-column gets blocked by the enzyme more quickly. The method developed in this diploma thesis has the advantage that due to the reduced analysis run-time the amount of samples can be doubled. For this method the recoveries were determined using the validation. For chloramphenicol the recovery is between 85.6 % and 90.0 %, for florfenicol between 90.1 % and 93.6 % and for thiamphenicol between 91.1 % and 93.9 %. The method is accredited and an international interlaboratory test for the analysis of chloramphenicol in milk was concluded positively. In the future the method can be extended with other matrices. If the MRL is higher, florfenicol amine can be analysed as well.