Novel biocompatible materials for in vivo two-photon polymerisation

Abstract

Zweiphotonenpolymerisation (2PP) ist eine vielseitig anwendbare laserbasierte Fertigungstechnik, die es ermöglicht, 3D Strukturen mit Mikro- und Nanometerpräzision herzustellen. Die Strukturen können dabei direkt nach einem computergenerierten Design (CAD) additiv aufgebaut werden. Für die 2PP benötigt man stark fokussiertes, femtosekunden-gepulstes Laserlicht. Die Wellenlänge der verwendeten Laser liegt normalerweise im nahen Infrarotbereich. Licht dieser Wellenlängen wird von biologischem Gewebe nur minimal absorbiert und verursacht bei moderaten Pulsenergien keine zellulären Schäden.<br />Theoretisch kann also 2PP in direktem Kontakt mit lebendem Gewebe und Zellen erfolgen. Mithilfe von biokompatiblen Formulierungen könnten so bioaktive Konstrukte geschaffen werden, die dynamisch modellierbar sind und ähnliche topografische, chemische und mechanische Anreize wie die natürliche extrazelluläre Matrix geben. Mittels 2PP könnte man so bestimmte Elemente dieser Umgebung verändern, ohne auf andere Faktoren Einfluss zu nehmen. Um diese Möglichkeiten auszuschöpfen, müssen jedoch zwei Einschränkungen der 2PP überwunden werden: die langen Prozesszeiten und die geringe Verfügbarkeit von passenden, für die 2PP optimierten photopolymerisierbaren Formulierungen.<br />In dieser Doktorarbeit beschreiben wir das Design und die Realisierung eines experimentellen Aufbaus für die 2PP, der es erlaubt, neuartige wasserbasierte Formulierungen zu verarbeiten. Hydrogelstrukturen können mit Schreibgeschwindigkeiten von über 100 mm/s aufgebaut werden, die bisher höchsten Schreibgeschwindigkeiten in der 2PP. Zusätzlich können diese Strukturen in vivo, in Gegenwart von lebenden biologischem Gewebe und Zellen geformt werden. Mithilfe eigens entwickelter, wasserlöslicher 2PP-Photoinitiatoren konnten wir Acrylat-Monomere in Formulierungen mit über 80% Wassergehalt vernetzen. Da diese Monomere eine Tendenz zur Michael-Addition an Proteine zeigen, untersuchten wir auch die Verarbeitbarkeit von Vinylester- und Vinylcarbonat-Monomeren. Im Gegensatz zu Acrylaten, die in potentiell toxische Polyacrylsäure zerfallen, degradieren Vinylester und Vinylcarbonat-Polymere zu biokompatiblen Polyvinylalkohol. Effiziente Thiol/-en-Chemie erlaubte uns, CAD-Präzisionsbauteile aus biokompatibler modifizierter Gelatine und Hyaluronsäure aufzubauen. In Toxizitätsanalysen untersuchten wir den Einfluss einzelner Komponenten von acrylatbasierten Formulierungen auf den Modellorganismus C. elegans. Schlussendlich zeigten wir 2PP in direktem Kontakt mit lebenden Nematoden.<br />

Two-photon polymerisation (2PP) is a versatile laser fabrication technique that allows the creation of 3D structures at micro- and nanometre precision. The structures are created additively in direct accordance to a computer-aided design (CAD). It requires tightly focused fs-pulsed light sources usually operating in the near infrared wavelength range. In this region, biological tissues exhibit a window of transparency and only absorb light minimally. When operating below a certain pulse energy threshold, the laser light does not cause any cellular damage. This theoretically allows inducing 2PP in the presence of living biological tissues and cells. Suitable biocompatible formulations that can render bioactive constructs would potentially allow building a dynamic environment with topographical, chemical and mechanical cues similar to that of the natural extracellular matrix. In that way, 2PP would allow to alter key elements of this environment without changing any other influencing factors. To explore these possibilities, 2PP has to overcome two main limitations, the slow process speeds and the lack of available optimised formulations.<br />In this thesis, we report the design and realisation of a 2PP experimental setup, which allows fabricating hydrogel structures from novel water-based formulations. Writing speeds of above 100 mm/s are feasible, which is the highest speed reported in 2PP. Moreover, the presented components have the potential to be formed in vivo, in the presence of living cells and tissues. Using water-soluble two-photon optimised photoinitiators, we could effectively cross-link acrylates in formulations of up to 80% water content. As acrylates show a tendency towards Michael addition to proteins, we explored the use of vinyl ester and vinyl carbonate monomers for 2PP. In contrast to acrylic polymers, which form potentially toxic poly (acrylic acid), vinyl ester and carbonate polymers form biocompatible poly (vinyl alcohol) during degradation. Efficient tiol/-ene chemistry enabled us to cross-link modified Gelatine and Hyaluronic Acid hydrogel precursors to form precise biocompatible constructs in good accordance to CADs. Using model organisms of type C. elegans, we performed lethal concentration assays exposing the animals to the components of one selected hydrogel formulation. Finally, as a proof-of-concept, we performed 2PP directly in the presence of a living nematode.