Monitoring of the encapsulation of a human rhinovirus in liposome vesicles

Abstract

Die Erforschung von Viren und deren Infektionen führte über die letzten Jahrzehnte zu einer Vielzahl an Publikationen, darunter etwa die vor kurzem veröffentlichten Arbeiten zu den Risiken von potentiell krebsbegünstigenden humanen Papillomaviren (HPVs), zoonotischen Viren wie den Vogelgrippeerregern oder auch Viren, die für epidemischen Krankheiten wie Ebola und Dengue verantwortlich sind. Bei allen genannten Beispielen ist ein Verständnis des Infektionsprozesses ein potentieller Schritt, um Wirkstoffe zu entwickeln, die effektiv die Verbreitung des Viruses als auch die Infektionsgefahr unterbinden. In diesem Zusammenhang ist besonders die in vitro Rekonstruktion des Infektionsprozesses eine kostengünstige und ethisch vertretbare Alternative zu in vivo Tierversuchen. Ein mögliches Modelsystem für in vitro Versuche sind Liposomen, kleine Lipidvesikel die so erzeugt werden können, dass sie Viren enthalten. Diese Vesikel können dann dazu genutzt werden, den Infektionsprozess zu erforschen. In dieser Arbeit wurden nun Liposomen verschiedener Größe bzw. Größenverteilungen erzeugt und dazu verwendet, humanes Rhinovirus Serotyp 2 (HRV-A2 bzw. HRV II oder RV-A2) zu verkapseln. Die Liposomen wurden dann unter Verwendung von „gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis“ (GEMMA) und Rasterelektronenmikroskopie (REM, engl. SEM) untersucht bzw. visualisiert. Die Aufreinigung der hergestellten Liposomen erfolgte durch Gradienten Zentrifugation / Flotation. Des Weiteren wurde eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE) sowie nachfolgend „Western Blotting“ eingesetzt, um das Vorhandensein von viralen Proteinen zu bestätigen. Der Prozess der Infektion mit humanen Rhinoviren, wie er in vivo nach der Aufnahme in Endosomen passiert, wird durch Acidifizierung induziert. Das synthethische Peptid GALA bildet unter bestimmten Bedingungen Poren in Lipidmembranen und würde so eine kontrollierte Azidifizierung der Liposomen durch Veränderung des äußeren pH-Werts ermöglichen. Als Vorarbeit zu dem künftigen Projektziel der Acidifizierung des Liposomeninnenraums wurden leere Liposomen mit GALA versetzt und mittels GEMMA deren Größe und deren Größenverteilung analysiert. Neben dem Hauptziel der Arbeit, der Herstellung potentiell HRV-A2-enthaltender Liposomen und deren Charakterisierung und Veränderung mit GALA, wurden weitere Versuche mit grün-fluoreszierendem-Protein (GFP) gelabelten P22 virusartigen Partikeln (engl. VLPs) durchgeführt. Diese wurden ebenso in Liposomen verkapselt und mittels GEMMA wie oben analysiert. Ausserdem wurde der Grad der Fluoreszenz der geformten VLPs mittels eines planaren Fluoreszenzscanner ermittelt.

Viruses have been investigated over decades and have inspired numerous publications, with recent work on the risks of viruses like cancer-risk-increasing human papillomaviruses (HPVs), zoonotic viruses like avian influenza viruses or viruses that caused epidemics like Ebola virus and Dengue virus. In any case, a better understanding of infection processes, especially for viruses that cause diseases, is a potential first step of inventing vaccines that are more effective in preventing the spreading of infections or in the best case stopping the infection process itself. In this regard, a reconstruction of the process in vitro is a cost-efficient and more ethical alternative to studies involving animals or in vivo experiments on human subjects. One potential model system for in vitro experiments are liposomes, small lipid vesicles mimicking cell membranes or exosomes. In this work, liposomes of different average sizes and size distributions were created and used to encapsulate human rhinovirus serotype 2 (HRV-A2 or HRV II or RV-A2). Ultimately, these vesicles are suggested to mimic the situation occurring in vivo upon uptake of virus particles in cells via endosomes and prior the transfer of the viral genome through the endosomal membrane and into the cytosol of the infected cell. Liposomes were then characterized via gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis (GEMMA) and scanning electron microscopy (SEM). Purification of the prepared liposomes was done using a gradient centrifugation / flotation technique. Subsequently, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) with subsequent Western Blotting was done to verify the presence of viral proteins. The process of infection with HRV, like it occurs after the uptake in endosomes in vivo, is stimulated by the acidification of the endosomes core. As a pre-work to the future target of internal acidification of liposomes, empty liposomes were also mixed with the synthetic peptide GALA and analysed using GEMMA. This peptide forms pores in the lipid membrane under certain conditions and thus would enable a controlled acidification from outside the liposomes. Besides the main aspect of this work, the creation of potentially HRV-A2-containing liposomes and their characterization and modification using GALA, additional efforts were made using green-fluorescent-protein (GFP) labeled P22 virus-like particles (VLPs) instead of HRV-A2 for encapsulation in liposomes to verify particle encapsulation within vesicles. These liposomes were then analysed by means of GEMMA. The fluorescence of the GFP-labeled P22 virus-like particles was also measured using a planar fluorescence laser scanner.