Phylogenetic analysis of borna disease virus strains from naturally infected animals

Abstract

The aim of this study was to gain more detailed insights into the genetic evolution and variability of Borna Disease Virus (BDV) under field conditions. We performed phylogenetic analysis of thirty-three Borna disease (BD) field viruses from different species including horse, sheep, donkey and other animal hosts such as deer, originating from naturally infected animals in endemic areas of Germany, Switzerland and the Principality of Liechtenstein. Additionally, since it has been suggested that German BD cases may have been associated with the BDV live-attenuated vaccine "Dessau", we included this strain in our study as well. Also, we traced the origin of seven classical and widely used BDV laboratory strains (of which nucleotide sequences were already available in the GenBank database) by genetic analysis, literature search and personal investigations. To our knowledge, this is the first complete documentation of the evolution and history of these reference strains. Four regions of the BDV genome were analysed: the complete p40, p10 and p24 genes as well as the intergenic region between p40 and p10. Five selected phylogenetic trees are presented and discussed. Phylogenetic analysis confirmed previous findings that BDV is genetically remarkably stable and contains highly conserved sequences. Sequence comparisons showed that BDV strains originating from the same host species are not closer related to each other than to isolates from other host species, e.g. equine field strains did not show a higher degree of homology to each other than to isolates from sheep, donkeys or other hosts. On the other hand, sequence analysis revealed that isolates from the same geographic area (e.g. Bavaria, Germany, or Graubuenden, Switzerland) showed a high degree of identity to each other at both nucleotide and amino acid level, independent of host species and year of isolation (up to 13 years,1985-1998). Furthermore all field strains investigated clearly segregated from the newly described and highly divergent BDV strain No/98, which originated from a non-endemic area in Austria. Although the BDV vaccine strain has been incriminated to be possibly involved in the spread of BDV in Germany, we identified only one BDV field strain, which exhibited high sequence identity to the live-attenuated vaccine strain. In relation to their origin and history, we were able to show that passaging of BDV laboratory strains (strain He/80, strain V and strain H1766) in cell culture or in experimental animals over years or even decades only led to few and punctual mutations in the viral genome. Interestingly, the controversially discussed isolate RW98 segregated clearly from strain He/80.

Borna disease virus (BDV) enthaelt RNA als Nukleinsaeure. Eine Besonderheit von BDV im Vergleich zu anderen RNA-Viren ist die extrem hohe Konservierung des Genoms. Mit einer Ausnahme sind alle bisher bekannten BDV-Isolate auf Nukleinsaeureebene zu 95-100% ident. Die eine Ausnahme betrifft ein in der Steiermark an BD erkranktes Pferd, bei dem das daraus isolierte Virus (mit "No/98" bezeichnet) nur etwa 85% Homologie zu allen anderen BDV-Isolaten aufweist. Diese Virusvariante ging in die Literatur als neuer BDV-Genotyp oder -Subtyp ein. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Ziele verfolgt: Es wurde erstmals eine groessere Anzahl von BDV-Isolaten (33) von natuerlicherweise an BD erkrankten Tieren molekularbiologisch untersucht. Die Viren wurden im Zeitraum 1985 - 1998 von Pferden, Schafen, Esel und Hirsch aus Deutschland, der Schweiz und Liechtenstein isoliert. Mittels Reverser Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) wurden bei allen Isolaten die Genregionen des gesamten p40, p10 und p24 sowie die intergenische Region zwischen p40 und p10 amplifiziert und deren Nukleinsaeuresequenz bestimmt. Die ermittelte Nukleinsaeuresequenz umfasste 20,5% des gesamten Virusgenoms. Die Nukleinsaeuresequenzen der verschiedenen Isolate wurden verglichen und Stammbaeume wurden fuer die einzelnen Regionen erstellt. Mittels dieser Methode ("Phylogenie / molekulare Epidemiologie") koennen Verwandtschaftsverhaeltnisse zwischen den Virusisolaten dargestellt werden. Ueber 30 Jahre lang wurde in Deutschland ein abgeschwaechter BDV-Lebendimpfstoff zur Immunisierung von Pferden verwendet. Dieser induzierte jedoch nur einen unzureichenden Impfschutz und stand sogar lange Zeit in Verdacht Impfdurchbrueche zu verursachen. Dieser Impfstoff ("Dessau-Vakzine") wurde in die Untersuchungen einbezogen, da er in Literaturberichten als eine moegliche Ursache der Ausbreitung von BDV angesehen wurde (wobei bisher kein Beweis dafuer vorlag). Ausserdem wurden in die Untersuchungen die wesentlichen weltweit fuer Experimente herangezogenen BDV Labor-Staemme inkludiert. Die Sequenz-Vergleiche und phylogenetische Analysen bestaetigten fruehere Ergebnisse, dass BDV genetisch aussergewoehnlich stabil ist und sehr konservierte Nukleinsaeuresequenzen enthaelt. Der maximale Unterschied zwischen den verschiedenen Virusisolaten betrug nur 4%, unabhaengig von der Tierart, aus der das Virus isoliert wurde und dem Jahr der Isolierung. Es konnte keine neue Virusvariante mit unterschiedlicher genetischer Komposition identifiziert werden. Auch Labor-Staemme bzw. BDV-Isolate, welche ueber Jahre in Zellkulturen oder in Versuchstieren passagiert wurden wiesen nur einige wenige Punktmutationen auf. Wie die Virus-Stammbaeume zeigten, war nur ein Virusisolat genetisch eng mit dem Impfstamm verwandt, d.h. einerseits, dass es vermutlich tatsaechlich zu einer Verbreitung des Impfvirus gekommen ist jedoch bei weitem nicht in dem Ausmass wie befuerchtet.