Characterization and analysis of FVIII - specific T cells in hemophilic mice treated with human factor VIII - development of new strategies for tolerance induction

Abstract

The development of neutralizing anti-FVIII antibodies in patients with hemophilia A is currently the most serious complication of factor VIII replacement therapy. Mechanisms regulating the immune response to factor VIII and the determinants of immunogenicity of FVIII products remain unclear. A murine knockout model of hemophilia A generated by a targeted disruption in exon 17 of the factor VIII gene was used in this Ph.D. thesis to study the kinetics and the features of FVIII-specific T cells that regulate the induction of anti-FVIII antibodies. These hemophilic E-17 mice have characteristics of antibody responses to human factor VIII similar to those in patients with hemophilia A. Intravenous injection of therapeutic doses of human FVIII give rise to high titers of anti-FVIII antibodies directed against both functional and non-functional parts of the FVIII molecule. The importance of CD40/CD40L (ligand) interactions for the initiation of the anti-FVIII immune response was also under investigation. The used treatment protocols mimicked either the replacement therapy of patients with factor VIII or the induction of tolerance against factor VIII in patients. Attention was in particular focused on the induction of neutralizing anti-FVIII antibodies and the Th1/Th2 polarization of FVIII-specific T cells. For this purpose, sensitive assays were developed that were suitable to analyze factor VIII-specific T cells on a single cell level. These assays were used to follow the kinetic of factor FVIII-specific T cells after treatment of hemophilic mice with human factor FVIII or after treatment with an anti-CD40L antibody (MR1) that blocked the CD40/CD40L interaction. The results of this work demonstrate that the induction of anti-FVIII antibodies is T cell dependent and is characterized by the induction of both Th1 and Th2 cells. This T cell response involves a complex interaction between different subsets of FVIII-specific helper T cells that might either stimulate or down-modulate the anti-FVIII-immune response. Furthermore it is shown that the induction of neutralizing anti-FVIII antibodies in hemophilic mice after treatment with human FVIII could be completely prevented by a blockade of CD40/CD40L interactions using a monoclonal anti-CD40L antibody (MR1). However, the initial blockade of CD40/CD40L interactions was not sufficient to induce a lasting immune tolerance against FVIII.

Ca. 30 % der Patienten mit schwerer Hämophilie bilden nach Behandlung mit Substiutions-produkten (Faktor VIII-Präparaten) inhibitorische Antikörper (Inhibitoren)gegen Faktor VIII. Das Auftreten von Inhibitoren stellt gegenwärtig die Hauptkomplikation bei der Behandlung von Hämophilie Patienten dar. Die Mechanismen, die die Immunantwort gegenüber Faktor VIII bestimmen, sind weitgehend unbekannt. Diese Arbeit untersucht die zelluläre Immunantwort gegen Faktor VIII als extrazelluläres Antigen. Es wurden Studien zur Kinetik und eine Charakterisierung der T Helfer Zellen (CD4+ Zellen ), die nach der Präsentation von Antigen aktiviert werden und die Produktion der Antikörper bildenden B Lymphozyten anregen, durchgeführt. Die Bedeutung der Interaktion von CD40/CD40 Ligand, für die Entstehung der anti-Faktor VIII Immunantwort wurde ebenso untersucht. Für die Studien wurde ein murines knockout Modell verwendet, das durch Ausschalten des Exon 17 im Faktor VIII Gen, mit Hämophilie A Patienten vergleichbare Immunantworten und Symptome ausbildet. Mittels Durchfluss-Zytometrie wurde die Kinetik und Charakteristik Faktor VIII spezifischer CD4+ Zellen analysiert. Die Entstehung der anti-Faktor VIII Antikörper wurde durch ELISA Systeme (Bestimmung der Gesamt-anti-FVIII Antikörper) und funktionelle Tests (Bethesda-Test zur Bestimmung der neutralisierenden Antikörper) analysiert. Zwischen dem Auftreten von FVIII-spezifischen CD4+ Zellen in der Milz und der Detektion von anti-FVIII Antikörpern im Plasma konnte eine zeitliche Korrelation festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Entstehung von anti-FVIII Antikörpern T Zellen abhängig ist und durch die Induktion von T-Helferzellen des Typ1 als auch des Typ 2 bestimmt wird. Durch Co-expressions-Analysen intrazellulärer Zytokine konnte gezeigt werden, dass FVIII-spezifische CD4+ Zellen IL-10 und IFN-g auch in einer Zelle gemeinsam in vitro produziert werden können. Es konnte auch gezeigt werden, dass das Induzieren neutralisierender anti-FVIII Antikörper durch Hemmung der CD40/CD40L Interaktion vollständig verhindert werden kann. Mit diesem Ansatz konnte Toleranz induziert werden, allerdings konnte keine dauernde Immuntoleranz gegen FVIII erreicht werden. Die gewonnen Erkenntnisse sollen helfen, neue Strategien zur Behandlung von Hämophilie A Patienten zu entwickeln und die Mechanismen, die für die Immunantwort gegen FVIII verantwortliche sind, besser zu verstehen.