Strategies to improve the myogenic outcome of skeletal muscle tissue engineering approaches through optimization of biomaterial properties and mechanical stimuli

Abstract

Mit bis zu 40% der Gesamtmasse des menschlichen Körpers ist die Skelettmuskulatur das am häufigsten vorkommende Gewebe und für Fortbewegung, Atmung, Thermogenese und aufrechte Haltung von entscheidender Bedeutung. Außerdem fungiert sie als endokrines Organ, indem sie Zytokine ausschüttet, die sich positiv auf verschiedene, insbesondere altersbedingte, Krankheiten wie Osteoporose, Alzheimer und Diabetes auswirken. Der Verlust der Skelettmuskulatur durch degenerative Muskelerkrankungen, volumetrischen Muskelverlust oder Sarkopenie (Muskelschwund bei älteren Menschen) ist daher einschneidend für die Gesamtfunktion des Körpers. Trotz der gravierenden Auswirkungen auf die Lebensqualität der Patient*innen gibt es immer noch keine wirksamen Behandlungsstrategien für Skelettmuskelpathologien, die von genetischen Defekten (z. B. Muskeldystrophien) und Alterung hervorgerufen werden. Das Gleiche gilt für volumetrischen Muskelschwund, dessen Behandlung entweder mit hohem Maß an Komplikationen oder mit mangelnder Wirksamkeit verbunden ist. In vitro (Krankheits-) Modelle, die mit den Techniken des Tissue-Engineerings (engl. Gewebekonstruktion) erzeugt wurden, können als alternative präklinische Plattformen dienen, um weitere Erkenntnisse über die molekularen Ursachen und potenziellen Behandlungen von Skelettmuskelpathologien zu gewinnen. Darüber hinaus stellen sie vielversprechende Behandlungsansätze als Implantate für den volumetrischen Muskelverlust dar. Erfolgreiches Erzeugen von Skelettmuskelgewebe hängt vom Zusammenspiel der drei Hauptkomponenten des klassischen Tissue-Engineering-Dreiecks ab: Zellen, Biomaterialien und stimulierende Faktoren. In dieser Arbeit soll die Frage beantwortet werden, wie sich die Auswahl und Herstellung des Biomaterials, sowie die Wahl der Stimulationsstrategien auf die eingesetzten Zellen auswirken. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, neue Einblicke in die geeignete Gestaltung der Kulturumgebung für ein verbessertes Ergebnis von Skelettmuskel-Tissue-Engineering Strategien zu geben.In Kapitel 1 werden zwei Studien vorgestellt, die den Einfluss des Elastizitätsmoduls und der Oberflächenstrukturierung von Biomaterialien auf die Entwicklung von Myoblasten aufzeigen. In der ersten Studie wurde festgestellt, dass geringe Veränderungen des Elastizitätsmoduls von Fibringerüsten das Differenzierungspotenzial von Myoblasten stark beeinflussen. Darüber hinaus verglichen wir die Kultivierung in 2D- und 3D-Umgebungen und die Reaktion von murinen und menschlichen Zellen auf die verschiedenen Bedingungen. Dabei zeigte sich, dass das Verhalten der Zellen in 2D-Kultur nicht auf komplexere 3D-Strukturen übertragen werden kann. Das Gleiche gilt für den Vergleich der Ergebnisse von murinen Myoblasten auf Zellen menschlichen Ursprungs. Dies unterstreicht, dass diese Faktoren bei der Weiterentwicklung von Tissue-Engineering Ansätzen berücksichtigt werden müssen, wodurch ihre Translation auf in vivo Umgebungen erleichtert wird. In der zweiten Studie setzten wir Femtosekundenlaser ein, um mikrostrukturelle Veränderungen auf Seidenfibroinsubstraten vorzunehmen. Es wurden parallele Rillen vom Biomaterial abgetragen, wodurch sich dessen Eignung als Gerüst für die myogene Entwicklung erheblich verbesserte.Kapitel 2 enthält eine umfassende Literaturübersicht über die Entwicklung dynamischer Skelettmuskelmodelle. Unser Ziel war es, biophysikalische und biochemische Stimuli zu identifizieren, die die in vivo Umgebung genau nachbilden und folglich die funktionellen und strukturellen Eigenschaften des erzeugten Gewebes verbessern. Darüber hinaus gehen wir auf das Potenzial dieser Plattformen als Krankheitsmodelle ein und stellen einen analytischen Arbeitsablauf vor, der das Identifizieren erfolgreicher Strategien für die Gewebezüchtung erleichtert.Im dritten und letzten Kapitel beschäftigt sich diese Arbeit damit, die Anpassung des Skelettmuskels an mechanische Belastungen in vitro zu modellieren, da Plastizität und eine hohe Regenerationsfähigkeit nach Verletzungen für die Funktionalität des Skelettmuskels entscheidend sind. Um die Lücke an in vitro Modellen, die diese Prozesse untersuchen, zu schließen, haben wir mit Hilfe eines Zug-Bioreaktors ein Tissue-Engineering Modell für die Adaption des Skelettmuskels an mechanischen Stress entwickelt. Die Überstimulation führte zur Aktivierung ruhender Myoblasten und zu überlastungsinduzierter Hypertrophie, was wir sowohl auf morphologischer als auch auf intrazellulärer Ebene charakterisierten.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit einen Beitrag zum Gebiet des Skelettmuskel-Tissue-Engineering leistet, indem sie die aktuellen Forschungsstrategien kritisch bewertet und neue Erkenntnisse zur Optimierung von Biomaterialien und Stimulationstechniken liefert. Dadurch wird das myogene Potential zukünftiger Skelettmuskel-Tissue-Engineering Ansätze, sowie die Relevanz von in vitro Modellen für intrazelluläre Mechanismen in gesundem und pathologischem Skelettmuskel verbessert.

Skeletal muscle is the most abundant tissue in the human body, comprising up to 40% of its total mass, and is crucial for locomotion, breathing, thermogenesis and the maintenance of an upright posture. Moreover, it acts as an endocrine organ by secreting cytokines with beneficial effects on various, particularly age-related, diseases, such as osteoporosis, Alzheimer’s disease and diabetes. Therefore, loss of skeletal muscle due to degenerative muscle disorders, volumetric muscle loss or sarcopenia (muscle wasting in the elderly) has severe negative implications on the body’s overall functionality. Despite the impact on the quality of the patients’ lives, there are still no effective treatment strategies for skeletal muscle pathologies caused by genetic disorders (e.g., muscular dystrophies) and aging. The same holds true for volumetric muscle loss, whose treatments entail either great donor site morbidity or a lack of effectiveness. Tissue-engineered in vitro (disease) models can serve as alternative pre-clinical platforms to gain further insights into the molecular causes and potential treatments of skeletal muscle pathologies. Furthermore, they present promising treatment approaches as implants for volumetric muscle loss. Successful generation of tissue-engineered skeletal muscle depends on an interplay between the three main components of the classical tissue engineering triad: cells, biomaterials and stimulating factors. This thesis aims at answering the questions how the choice and manufacturing of the biomaterial, as well as the choice of stimulation strategies affect the applied cells. The overall aim hereby was to provide insights into appropriate designs of the culture environment for an improved myogenic outcome of tissue-engineered skeletal muscle.In chapter 1, two studies are presented that highlight the influence of elastic modulus and surface patterning of biomaterials on the myogenic development of myoblasts. The first study found that subtle changes of the elastic modulus of fibrin scaffolds greatly impact the differentiation potential of myoblasts. Moreover, we compared cultivation in a 2D and a 3D environment and the response of murine and human cells to the different settings. Hereby, we saw that cellular behavior in 2D setups cannot be translated to more complex 3D structures. The same holds true for translation of findings from murine myoblasts to cells of human origin. This highlights that these factors need to be considered when advancing tissue engineering approaches, which will facilitate their translation to in vivo settings. In the second study, we applied femtosecond lasers to introduce microstructural changes onto silk fibroin substrates. Parallel grooves were ablated from the biomaterial, which successfully increased its suitability as a scaffold for myogenic development.Chapter 2 provides a comprehensive literature review on the design of dynamic skeletal muscle models. We aimed at identifying biophysical and biochemical stimuli that closely recapitulate the in vivo environment and consequently improve functional and structural characteristics of the engineered tissue. Further, we elaborate on the potential of these platforms in disease modeling and present an analytical workflow for facilitated identification of successful tissue engineering strategies.In the third and last chapter, this thesis engages in modeling the adaptation of skeletal muscle to mechanical stress, as plasticity and a high capacity to regenerate after injuries are crucial for skeletal muscle functionality. Since there is a lack of in vitro models that study these processes, we aimed to create a tissue-engineered model for skeletal muscle adaptation to mechanical stress using a strain-bioreactor. We triggered myoblast activation and overload-induced hypertrophy and characterized the model on a morphological, as well as on an intracellular level.In summary, this thesis contributes to the field of skeletal muscle tissue engineering by critically assessing current research strategies and introducing new insights in biomaterial optimization and stimulation techniques. Thereby, the myogenic outcome of future skeletal muscle tissue engineering approaches, as well as the relevance of in vitro models of skeletal muscle mechanisms and pathologies will be improved.