Design and expression of recombinant penicillin V and aculeacin A acylases in E. coli

Abstract

Resistenzen gegen antimikrobielle Wirkstoffe und die Suche nach neuen Behandlungsmöglichkeiten gehören zu den großen Herausforderungen der heutigen Zeit. Aus diesem Grund sind Penicillin V Acylase von Streptomyces lavendulae ATCC 13664 (SlPVA) und Aculeacin A acylase von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 (AuAAC) Enzyme von großem Interesse. Beide gelten als wichtige Katalysatoren der semisynthetischen Produktion antimikrobieller Wirkstoffe. Des Weiteren wird vermutet, dass diese selbst wirksam gegen Bakterien sein können, indem sie Quorum Quenching als Wirkmechanismus nutzen. Die Enzyme konnten bereits in Streptomyces lividans produziert werden. Als filamentöses Bakterium ist Streptomyces lividans ein komplizierter Produktionsorganismus: er ist aufwendig zu kultivieren, braucht lange Fermentationszeiten und wird leicht kontaminiert. Deswegen gilt heterologe Proteinproduktion in Escherichia coli als vorteilhaft.Im Zuge dieser Arbeit wurde eine Codon-Optimierung der Gene pva und aac, die SlPVA und AuAAC kodieren, durchgeführt. Diese rekombinanten Gene wurden in das kommerzielle Plasmid pET 22b kloniert, um die Proteine in E. coli zu exprimieren. Zudem wurden Immobiliserungsexperimente vorbereitet. Dazu wurden Fusionsgene mit dem gfp Gen und der Gensequenz, welche die Substratbindungsdomäne (SBD) der PHB Depolymerase von Streptomyces exfoliates kodiert, hergestellt und in das Plasmid pET 22b kloniert. Daraufhin wurde die Produktion von rekombinanten SlPVA und AuAAC in verschiedenen E. coli Stämmen angestrebt. Auch das Produktionsmedium wurde optimiert. Schlussendlich konnten beide Enzyme als unprozessierte Inclusion Bodies in E. coli BL21 (DE3) produziert werden. Jedoch konnte kein lösliches, aktives Protein hergestellt werden.Diese Arbeit kann als Grundlage verwendet, um aktives Protein in E. coli herzustellen oder um das Refolding der Inclusion Bodies zu erforschen.

Antimicrobial resistance and the search for new therapies is one of the great challenges humanity faces nowadays. In this sense, penicillin V acylase from Streptomyces lavendulae ATCC 13664 (SlPVA) and Aculeacin A acylase from Actinoplanes utahensis NRRL 12052 (AuAAC) are enzymes of great interest. Both of them are important catalysts in the synthesis of semisynthetic antimicrobials as well as they also have been found to potentially act as antimicrobials themselves by quorum quenching processes. Extracellular heterologous production of both enzymes has already been achieved in S. lividans. However, production in this organism is cumbersome due to its nature as a filamentous bacterium. The drawbacks include that they are not easy to grow, need long fermentation times and are easily contaminated. In this sense, heterologous protein production in E. coli can be regarded as advantageous.In the course of this work, the synthetic pva and aac codon-optimized genes, encoding SlPVA and AuAAC respectively, were cloned into the commercial plasmid pET 22b for expression in E. coli. Furthermore, for potential immobilisation experiments fusion genes with gfp gene as well as the substrate binding domain (SBD) sequence of phaZSex gene, that encodes the PHB depolymerase from Streptomyces exfoliatus, were designed and cloned into pET 22b. Hereafter, production of recombinant SlPVA and AuAAC in different E. coli strains was attempted. Production medium was optimized and both enzymes were obtained as unprocessed inclusion bodies in E. coli BL21 (DE3). Unfortunately, active soluble protein could not be obtained.However, obtained results can be used for designing further experiments regarding active processed protein as well as refolding of inclusion bodies.