Aptamers are short single stranded oligonucleotides that can fold into specific three-dimensional structures which allows them to bind to a target with high specificity and affinity. In this diploma thesis multiple analytical methods for the characterization of bacterial whole cell binding aptamers were established and tested, namely fluorescence spectroscopy, epifluorescence microscopy and quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Using these methods, the binding properties of a total of seven Escherichia coli targeting DNA aptamers from three different publications were evaluated. Depending on the aptamer, it was shown that not all methods are applicable for each and every candidate due to differences in the amounts of bound aptamer per cell. As the methods differ in their sensitivities and dynamic range, low amounts of bound aptamer can only be detected by qPCR. Moreover, labeling with fluorophores for fluorescence-based methods may have affected the binding properties of some of the aptamers and thus led to inconsistencies in the obtained results. Comparison of the results to those reported in the publications showed that measurements sometimes are not reproducible, even if the same method as originally used was applied. This might either indicate a lack of vital information in the reported experimental procedures or a need for more rigorous testing to confirm binding. In conclusion, the developed methods and standard operating procedures serve as a valuable basis for the characterization of other bacterial cell targeting DNA aptamers. Additionally, first recommendations for possible analysis via flow cytometry were made
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Aptamere sind kurze einzelsträngige Oligonukleotide die sich zu spezifischen dreidimensionalen Strukturen falten können, was ihnen erlaubt mit hoher Spezifität und Affinität an ein Zielmolekül zu binden. In dieser Diplomarbeit wurden mehrere analytische Methoden für die Charakterisierung von Bakterienzellen bindenden Aptameren etabliert und getestet. Diese sind: Fluoreszenz Spektroskopie, Epifluoreszenz Mikroskopie und Quantitative Polymerasekettenreaktion (qPCR). Mithilfe dieser Methoden wurden die Bindungseigenschaften von insgesamt sieben Escherichia coli bindenden DNA Aptameren von drei verschiedenen Publikationen evaluiert. Es konnte gezeigt werden, dass nicht alle Methoden für jeden Aptamer Kandidaten anwendbar sind, wahrscheinlich aufgrund von unterschiedlichen Mengen an gebundenem Aptamer pro Zelle. Da sich die Methoden in ihrer Sensitivität und ihrem dynamischen Bereich unterscheiden, konnten geringe Mengen an gebundenem Aptamer nur mit qPCR detektiert werden. Weiters könnte das Modifizieren der Aptamere mit fluoreszierendem Label für die fluoreszenz basierenden Methoden die Bindungseigenschaften von einigen Aptameren beeinflusst haben, was so zu inkonsistenten Resultaten geführt hat. Ein Vergleich der Ergebnisse mit jenen der Publikationen hat gezeigt, dass diese nicht immer reproduzierbar sind, selbst wenn die gleichen Methoden angewandt wurden. Dies könnte entweder auf ein Fehlen von wichtigen Informationen in den berichteten Prozeduren oder die Notwendigkeit für gründlicheres Testen hinweisen, um die Bindung zu bestätigen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Methoden und Standard Prozeduren als wertvolle Basis für die Charakterisierung von anderen Bakterienzellen bindenden DNA Aptameren dienen kann. Weiters wurden erste Empfehlungen für eine mögliche Analyse mittels Durchflusszytometrie gegeben.
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Abweichender Titel nach Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
