Novel mid-infrared based methods for milk analysis and bioprocess monitoring

Abstract

Mid-infrared (IR) spectroscopy provides chemically meaningful information by detecting absorption of IR radiation as result of excitation of fundamental molecular vibrations. Compared to many other techniques applied within the biochemical field, it offers advantages such as short measurement times, low costs, minimum sample preparation and non-destructive measurement. In this work, especially the advantages of quantum cascade lasers (QCLs), representing novel high-power mid-IR light sources, were used to develop new mid-IR based methods for milk analysis and bioprocess monitoring.First, a mid-IR transmission setup for protein analysis in aqueous solutions was developed that achieved a limit of detection (LOD) as low as 0.0025 mg/mL, thus clearly outperforming previous academic setups and high-end Fourier-transform IR (FTIR) spectrometers. This improvement was accomplished by combining a latest-generation external cavity (EC)-QCL with a balanced detection scheme that reduced the noise level by a factor of up to 20 in balanced mode compared to single-channel measurements. The large optical path length of 26 μm allowed for robust spectra acquisition of the amide I + amide II band when analyzing aqueous protein samples. Here, successful identification of protein secondary structures was possible at concentrations of 0.1 mg/mL using measurement times of 45 s. This opens a wide range of possible future applications including determination of different proteins in human milk, which cannot be readily met by conventional FTIR spectroscopy.Furthermore, mid-IR based fatty acid analysis in milk was demonstrated using a novel approach based on solvent-free lipid separation and attenuated total reflection (ATR)-FTIR spectroscopy. The recorded spectra of the lipid fraction showed distinctly better resolved fatty acid related features compared to transmission spectra of whole milk samples. Partial least squares (PLS) based multivariate calibration equations were calculated by relating ATR-FTIR spectra to gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) reference concentrations, showing excellent results for the most important sum parameters as well as for certain individual fatty acids in both, human milk and bovine milk. Moreover, the developed approach inherently eliminated covariation structures between individual fatty acid concentrations and total fat content, which is a common problem in FTIR based determination of the milk fatty acid profile. All calibration equations were successfully validated by relating important spectral wavenumber regions to spectral features from milk fatty acids. Consequently, the developed method bears great potential for future high-throughput and accurate fatty acid determination in bovine and human milk.For bioprocess monitoring, a commercially available EC-QCL based mid-IR spectrometer was used that allows robust and sensitive measurements of protein spectra beyond the amide I and II region. This spectrometer was thoroughly benchmarked against a high-end FTIR spectrometer, showing a noticeably smaller footprint, approximately three times larger applicable optical path lengths and similar sensitivity without the need of liquid nitrogen cooling. Subsequently, this spectrometer was coupled to a preparative liquid chromatography (LC) system to enable inline monitoring of the protein secondary structure. Several runs based on ion exchange chromatography (IEX) were monitored. Here a major challenge was caused by IR absorbance bands due to the applied NaCl gradient that overlap with noticeably smaller protein bands. For this purpose, a novel background correction approach was presented, allowing for flexible compensation of different linear and step gradients, revealing high-quality protein spectra. Finally, QCL-IR spectroscopy was employed for monitoring of size exclusion chromatography (SEC) runs with overlapping protein peaks. Here, chemometric evaluation revealed spectra of the pure proteins as well as their concentration profiles across the run. These results were compared to offline reference spectra and high-performance LC (HPLC) measurements of the collected fractions, showing excellent agreement in both cases. Consequently, EC-QCL based mid-IR spectroscopy represents a highly flexible process analytical technology (PAT) tool for providing inline information about proteins from bioprocesses that was previously only accessible by time- and labor-intesive offline methods.

Die Spektroskopie im mittleren Infrarot (MIR) liefert chemische Informationen durch Absorption von Infrarotstrahlung, die von fundamentalen Molekülschwingungen herführt. Verglichen mit vielen anderen Techniken, die in der Biochemie Einsatz finden, bietet die MIR Spektroskopie Vorteile wie kurze Messzeiten, niedrige Kosten, minimale Probenvorbereitung und zerstörungsfreien Einsatz. In dieser Arbeit wurden speziell die Vorteile von Quantenkaskadenlasern (QCLs), welche MIR Lichtquellen mit hoher Leistung sind, eingesetzt um neue MIR Methoden für die Analyse von Milch und die Überwachung von Bioprozessen zu entwickeln.Zuerst wurde ein MIR Transmissionssetup für die Analyse von Proteinen in wässriger Lösung entwickelt, welches eine Nachweisgrenze (LOD) von 0.0025 mg/mL erreichte und damit zuvor entwickelte Forschungsaufbauten sowie high-end Fourier-Transform-Infrarot (FTIR) Spektrometer klar übertrifft. Diese Verbesserung wurde durch die Kombination eines externen Resonator (EC)-QCL der neuesten Generation und einem „balanced detection“ Schema, welches das Rauschen im „balanced mode“ verglichen mit Einkanal Messungen bis zu einem Faktor von 20 reduzierte. Die große optische Schichtdicke von 26 μm ermöglichte robuste Aufnahme von Spektren im Bereich der Amid I + Amid II Banden von Proteinen. Hier konnten Protein Sekundärstrukturen erfolgreich bei Konzentrationen von 0.1 mg/mL identifiziert werden bei Messzeiten von 45 s. Dies öffnet eine breite Auswahl an möglichen zukünftigen Anwendungen, inklusive Bestimmung von einzelnen Proteinen in Muttermilch, was derzeit mit konventioneller FTIR Spektroskopie nicht möglich ist.Außerdem wurde eine MIR basierte Methode zur Analyse von Fettsäuren in Milch entwickelt, die lösungsmittelfreie Lipidabtrennung und abgeschwächte Totalreflexion (ATR)-FTIR Spektroskopie kombiniert. Die aufgenommenen Spektren zeigten deutlich besser aufgelöste spektrale Merkmale die auf Fettsäuren zurückzuführen sind als Transmissionsmessungen von Vollmilch. Multivariate Kalibrationen basierend auf Regressionen der partiellen kleinsten Quadrate (PLS) wurden berechnet indem ATR-FTIR Spektren mit Referenzkonzentrationen aus Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Messungen in Bezug gebracht wurden. Diese zeigten sehr gute Ergebnisse für die wichtigsten Summenparameter und bestimmte individuelle Fettsäuren in Kuh- und Muttermilch. Außerdem verhindert der entwickelte Ansatz mögliche Kovarianzen zwischen individuellen Fettsäurekonzentrationen und dem Gesamtfettgehalt inhärent, was sonst ein häufiges Problem in FTIR basierter Bestimmung des Milchfettsäureprofils ist. Alle Kalibrationen wurde erfolgreich validiert indem wichtige Wellenzahlbereiche zu spektralen Merkmalen von Fettsäuren in Bezug gebracht wurden. Folglich hat die entwickelte Methode großes Potential für zukünftige akkurate Fettsäurebestimmung von Kuh- und Muttermilch mit hohem Durchsatz.Für die Überwachung von Bioprozessen wurde ein kommerziell erhältliches EC-QCL basiertes MIR Spektrometer eingesetzt, welches robuste und empfindliche Messungen von Proteinspektren über Protein Amid I und II Region hinaus ermöglicht. Dieses Gerät wurde zuerst gründlich mit hochwertigen FTIR Spektrometer verglichen. Hier wurde gezeigt, dass die deutlich kompaktere Bauweise, die circa dreimal höher anwendbare Schichtdicke und eine ähnliche Empfindlichkeit ohne Kühlung des Detektors mittels Flüssigstickstoff erreicht wird. Danach wurde das Spektrometer mit einem präparativen Flüssigchromatographie (LC) System gekoppelt um inline Messungen der Protein Sekundärstruktur zu ermöglichen. Mehrere chromatographische Läufe basierend auf Ionentauschchromatographie (IEX) wurden durchgeführt. Hier wurden Natriumchlorid Gradienten eingesetzt die zu Absorptionsbanden führten, welche mit deutlich kleineren Proteinbanden überlappten. Für diesen Zweck wurde eine neue Hintergrundkorrekturmethode entwickelt, welche flexible Kompensation von unterschiedlichen linearen und Stufengradienten ermöglichte und dadurch qualitativ hochwertige Proteinspektren offenlegte. Schließlich wurde EC-QCL Spektrometer auch eingesetzt um Trennungen mittels Größenausschluss-Chromatographie (SEC) mit überlappenden Proteinpeaks zu überwachen. Hier wurden durch chemometrische Auswertung Spektren von den reinen Proteinen sowie deren Konzentration über den chromatographischen Lauf erhalten. Diese Ergebnisse wurden mit offline Referenzspektren und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Messungen der gesammelten Fraktionen verglichen, was in beiden Fällen sehr gute Übereinstimmung zeigte. Folglich ist EC-QCL basierte MIR eine hochflexible „Process Analytical Technology“ (PAT) Methode mit der inline Information über Proteine in Bioprozessen erhalten werde kann, welche in der Vergangenheit nur mit zeit- und kostenaufwendigen offline Methoden zugänglich war.