Interleaved localised 1H/31P nuclear magnetic resonance spectroscopy of skeletal muscle

Abstract

Nuclear magnetic resonance (NMR) has been used as a spectroscopic method in physics and chemistry before it was developed to become a diagnostic imaging tool in medicine. When NMR Spectroscopy is applied to human tissue, metabolism can be studied in normal physiological and pathological states in vivo. Metabolite concentrations and rates can be monitored dynamically and with localisation of a defined region of interest. The "window" which is opened for observation, i.e. which quantities are measured, depends on the nucleus used for RF excitation.<br />Mechanisms of adenosine tri-phosphate (ATP) resynthesis, as a direct source of energy for muscle contraction, are phosphocreatine (PCr) splitting, glycolysis, beta-oxidation and, finally, oxidative phosphorylation. Whilst the dependency of these processes' fractional contribution to muscular energy supply on exercise type and duration is well known, quantitative models of the regulating mechanisms involved are still subject of current research. A large fraction of the established knowledge about metabolism is based on biochemical analysis of tissue acquired invasively (e.g. microdialysis and open-flow microperfusion) or representing averaged metabolic concentrations for the whole body (via serum metabolites or gas exchange analysis). Localised NMR spectroscopy, however, is capable of non-invasively acquiring time-resolved data from a defined volume of interest, in vivo.<br />In contrast to the vast majority of MRS studies investigating metabolism, where spectra of a single nucleus (commonly 1H, 31P or 13C) were acquired or several MR spectra with different nuclei were measured in separate experiments, this work opens an additional "window" on muscle metabolism by interleaved localised acquisition of 1H and 31P NMR spectra from human calf muscle in vivo, during rest, exercise and recovery, in a single experiment. Using this technique, the time courses of the concentrations of phosphocreatine, inorganic phosphate (Pi), ATP, total creatine, and lactate in human gastrocnemius muscle can be quantified directly, without using physiological model assumptions, while intracellular pH can be derived from the chemical shifts of Pi and PCr in 31P MR spectra. Quantifying intramuscular lactate by NMR spectroscopy is a challenging task, because the lactate signal is overlapped by strong lipid resonances and exhibits modulations which dependent on factors hard to control or measure, like muscle fibre orientation relative to the magnetic field, intra- and extracellular compartmentation and relaxation times.<br />The thesis is organised into an introduction to muscle physiology and methods for studying metabolism, followed by a theoretical chapter on localised NMR spectroscopy using STEAM and the localised double quantum filter (DQF) pulse sequence which was implemented for in vivo lactate detection. The theoretical sections are supplemented by an outline of the product operator formalism to describe the NMR spectroscopy experiments mathematically, in the appendix.<br />The second part describes the experiments which have been conducted at the 3 Tesla whole body NMR scanner installed at the "High Field MR Centre of Excellence", Vienna Medical University: The non-magnetic exercise rig constructed for activation of human calf muscle during NMR measurements is presented. Examples of basic muscle MR spectroscopy are given and the interleaved 1H and 31P STEAM sequence implemented on the NMR scanner is explained in detail along with its application during calf muscle exercise, employing the exercise rig.<br />Then the localised double quantum filter (DQF) pulse sequence is introduced which was developed for detection of the lactate CH3 resonance and suppression of overlaying lipid signals. Lactate quantification is only possible with this method due to the incorporation of knowledge about ordering effects published by other groups in the previous year. The final chapter of the experimental part comprises the time resolved interleaved localised DQF, 1H and 31P STEAM measurements during ischaemic calf muscle exercise using the exercise rig.<br />In conclusion, 31P MRS data and lactate concentrations measured simultaneously by 1H MRS help to confirm model assumptions about cellular proton buffering capacity. Questions on metabolic efflux can be addressed when studying lactate, pH and PCr changes during recovery from ischaemic exercise with high time resolution, as well as control of glycogenolysis and coordination of oxidative versus glycolytic ATP production in aerobic and ischaemic exercise. Perspectives are further improvement of specificity by multi nuclear spectroscopic imaging and an increase of sensitivity and time resolution by transferring the technique to an even higher field strength.<br />

Wird Kernspin-Magnetresonanz (NMR) als spektroskopisches Verfahren in vivo am Menschen angewandt, bietet die NMR-Spektroskopie (MRS) die Möglichkeit, Stoffwechselvorgänge in physiologischen und pathologischen Fragestellungen anhand der Metabolitenkonzentrationen und ihrer Änderungsraten nichtinvasiv, lokalisiert und zeitaufgelöst zu verfolgen, wobei abhängig vom angeregten Kern verschiedene "Beobachtungsfenster" also das Ensemble messbarer Größen, genutzt werden können.<br />Mechanismen der Resynthese von Adenosintriphosphat (ATP) als direktem Energieträger für Muskelkontraktionen sind u.a. Spaltung von Kreatinphosphat (PCr), Glykolyse, beta-Oxidation und schließlich oxidative Phosphorylierung. Während der Beitrag dieser Stoffwechselprozesse zur Deckung des Energiebedarfs der Muskulatur in bekannter Weise abhängig ist von Art und Dauer der Beanspruchung, ist die Funktionsweise ihrer Regulationsmechanismen noch Gegenstand aktueller Forschung. Ein großer Anteil des Wissens über den Metabolismus des Muskels basiert auf biochemischen Analysen von invasiv gewonnenem Gewebe oder der Bestimmung von Parametern die lediglich eine Aussage über den Stoffwechsel des Gesamtorgansmus zulassen. Mittels lokalisierter MRS können hingegen zeitaufgelöste Daten aus einem definierten Volumen in vivo, nichtinvasiv akquiriert werden.<br />Im Gegensatz zur überwiegenden Mehrheit der publizierten Studien, in denen MRS mit der Anregung nur eines Nuklids durchgeführt wurden, öffnet diese Arbeit ein weiteres Fenster zur Beobachtung des Metabolismus, indem multinukleare MRS in ein einziges Experiment verschachtelt ("interleaved") während Ruhe, Belastung und Erhohlungsphase der Wadenmuskulatur in vivo durchgeführt wurde. Mit dieser Methodik sind unter anderem die Konzentrationen von Kreatinphosphat, anorganischem Phosphat, ATP, totalem Kreatin und erstmals auch Laktat im menschlichen Gastrocnemius-Muskel direkt, d.h. ohne physiologische Modellannahmen einer nichtinvasiven lokalisierten zeitaufgelösten Messung zugänglich und der intrazelluläre pH-Wert kann ebenfalls anhand von 31P-Spektren bestimmt werden. Die Quantifikation von Laktat mittels MRS stellt dabei eine besondere Herausforderung dar, da das Laktatsignal im Muskel erstens von vielfach stärkeren Signalen des intramuskulären Fetts überlagert ist und zweitens orientierungsabhängige Modulationen aufweist, deren Verhalten u.a. von der Muskelfaserorientierung abhängt.<br />Die Arbeit gliedert sich in eine Einführung zur Muskelphysiologie und der zum Studium des Metabolismus angewandten Methoden, gefolgt von einem Kapitel zur theoretischen Beschreibung der lokalisierten NMR-Spektroskopie mittels STEAM und der zur Laktat-Quantifizierung im Muskel entwickelten Doppelquantenfilter-Pulssequenz (ergänzt durch eine Zusammenfassung des Produktoperator-Formalismus zur Beschreibung des Doppelquantenexperiments für die Laktat-Quantifizierung im Anhang).<br />Der zweite Teil ist den am 3 Tesla Ganzkörper NMR-Scanner des "Exzellenzzentrums Hochfeld-MR" an der Med. Univ. Wien durchgeführten Experimenten gewidmet. Er beginnt mit der Beschreibung des im Zuge des Projekts konstruierten Geräts zur Aktivierung der Wadenmuskulatur während der Messung im NMR-Gerät und einem Kapitel mit Beispielen einfacher Muskel-MRS. Weiters ist die aus der Verschachtelung zweier STEAM-Sequenzen, (1H und 31P) bestehende multinukleare Spektroskopie-Methode beschrieben. Ein weiteres Kapitel behandelt die lokalisierte Doppelquantenfilter-Sequenz, welche zur Unterdrückung starker, die Laktat-CH3-Resonanz überlagernder Lipidsignale der Muskel-Spektren entwickelt wurde. Dabei sind bei der Quantifizierung Ordnungseffekte im Muskelgewebe zu berücksichtigen.<br />Schließlich wird das Experiment beschrieben, in dem Doppelquanten-gefilterte Laktat-Spektren, 1H- und 31P-STEAM Spektren in einer einzigen Messung zeitaufgelöst aufgenommen wurden, während die Versuchsperson im Magneten durch ischaemische Plantarflexion und mit Hilfe der beschriebenen Konstruktion die Wadenmuskulatur aktiviert.<br />Der abschließende Teil besteht aus den Schlussfolgerungen, dass die mit 31P-NMR-Spektroskopie in vivo akquirierten Daten und gleichzeitig bestimmte Laktatkonzentration der Verifikation von Meodellen der intrazellulären H+-Pufferkapazität dient und die Methodik geeignet ist, aus Laktatkonzentration, pH und PCr während Erholung nach ischaemischer Belastung metabolischen Fluss zu bestimmen und während aerober und anaerober Belastung angewandt werden kann, um die Kontrollmechanismen von Glykogenoslyse und Koordination oxidativer und glykolytischer ATP-Produktion zu studieren. Mögliche Weiterentwicklungen der Methodik sind weitere Verbesserung der Spezifizität, etwa durch multinukleare Spektroskopische Bildgebung und Steigerung der Sensitivität und damit verbunden der Zeitauflösung, durch den Einsatz noch höherer Feldstärken.