Development of proteomic tools for the identification of PC-1 associated proteins in human embryonic kidney 293 cells

Abstract

Die Überexpression von PC-1 (plasma cell glycoprotein 1) oder der Polymorphismus K173Q Variante von PC-1 wird mit Insulinresistenz in Verbindung gebracht. Jedoch ist die Funktion von PC-1 im Insulin-Signalweg nicht geklärt. Um die Insulinresistenz verstehen zu können und auch später zu vermeiden, ist es essentiell, den zugrunde liegenden Stoffwechselweg zu verstehen.<br />Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit nach Bindungspartnern von PC-1 gesucht. Deren Identifikation könnte Aufschluss über die Rolle von PC-1 im Insulin-Signalweg geben und PC-1 in einen größeren Kontext einbetten.<br />Die Proteine, die an PC-1 Wildtyp (wt) oder an PC-1 K173Q (mut) binden, wurden mit einem spezifischen Antikörper gegen PC-1 präzipitiert und nachfolgend der 2-dimensionalen differentiellen Gelelektrophorese (DIGE) unterworfen. Eine Wechselwirkung von PC-1 und dem Protein Insulinrezeptor [alpha]-Kette wurde beobachtet und deshalb könnte die Kopräzipitation von PC-1 assoziierten Proteinen Aufschluss über den Insulin-Signalweg geben. Die relative Quantifizierung von Proteinen erfolgte über DIGE Experimente. Die vorläufige Identifikation erfolgte mittels MALDI MS und nachfolgendem Datenbankvergleich der erhaltenen tryptischen Fingerabdrücke der interessanten Proteine, sowie durch Teilaminosäurensequenzen aus Spaltpeptiden erhalten durch MS/MS-Experimente erhalten aus Hochenergie-kollisionsinduzierte Dissoziation (HE CID) als auch aus PSD (post source decay).<br />Die ersten Experimente mit Silber-gefärbten 2D-Gelen waren beschränkt auf qualitative Aussagen über vorhandene Proteine. 12 Proteine in den Silber-gefärbten 2D-Gelen identifiziert werden, nämlich Vimentin (VIM), Tropomyosin 3 (TPM3), Drebrin 1 (DREB), alpha-Aktinin 4 (ACTN4), eukaryotischer Translationsinitiierungsfaktor 2 alpha Untereinheit (eIF-2[alpha]), Elongationsfaktor 2 (EF-2) and 60S azidische Ribosomenprotein P0 (RLP0), Glukose regulierendes Protein 78 (GRP78) and T-Komplexprotein 1 epsilon Untereinheit (TCPE), Phosphoribosylaminoimidazol-Carboxylase (ADE2), Valosin-enthaltendes Protein (VCP) und Rezeptor aktivierte Proteinkinase 1 (RACK1). Drei interagierten ausschließlich mit PC-1 wt (VIM, ACTN4 und VCP) und eines nur mit PC-1 mut (GRP78). Die Fluoreszenz-Markierung (DIGE) erlaubte eine relative Quantifizierung von Proteinen und damit Aussagen über die Expression. Der Vergleich der Gesamtlysate aus den DIGE Experimenten ergab drei unterschiedlich regulierte Proteine nämlich das Hitzeschockprotein 60-kD (HSP60), die Proteindisulfidisomerase A3 (PDI A3) und das Aktin-bindende Protein (CAP-G), eines davon war auch in den Immunopräzipitaten unterschiedlich exprimiert, PDI A3. In Summe wurden 11 Proteine in den Immunopräzipitaten verschieden assoziiert mit PC-1 gefunden, die erst durch die Abreicherung stark exprimierter Proteine wie Serumalbumin detektierbar wurden. Diese Proteine waren folgende: F-Aktin "capping protein" alpha-2 subunit (CapZ [alpha]-2), eukaryotischer Translationelongationsfaktor 1 gamma (EEF1G), 34/67 kD Lamininrezeptor 1 (LAMR1), T-Komplexprotein 1 beta Untereineit (TCPB), PDI A3, PDI A6, "Thioredoxin-like" Protein 2 (TXNL-2), GAIP (G-alpha interagierendes Protein) interagierendes Protein (GIPC1), MAP (mitogen aktiviertes Protein) Proteinkinase 2 (MARK2, EMK1), Annexin 2 (ANXA2) und ATP Synthase, H+ transportierend, mitochondrialer F1 Komplex beta Untereinheit (ATP5B).<br />Keines der PC-1 assoziierten Proteine in den beiden verschiedenen Experimentansätzen (2D-Gele Silber-gefärbt und DIGE Gele) waren ident.<br />Deshalb wurde eine unabhängige Detektionsmethode gewählt, die Western Blot Analyse. Die Verifikation der identifizierten Proteine mit kommerziell erhältlichen Antikörpern in wiederholten Versuchen mittels Western Blot gelang nicht. Das Protein ANXA2, welches im Zusammenhang mit PC-1 beim Mineralisationsprozess Bedeutung hat, konnte zwar in der 2D-PAGE Studie als PC-1 interagierendes Protein identifiziert werden, aber dessen Verifikation war trotzdem im Western Blot nicht erfolgreich.<br />Ein grundlegender Unterschied zwischen den Experimenten der 2D-PAGE (DIGE und Silberfärbung) in Kombination mit der MS und Western Blot Analyse waren die verwendeten Kulturzellen, sie waren nicht dieselben, was ein unterschiedliches Proteinmuster erklären könnte.<br />Soweit durch diese Arbeit beurteilt werden kann, ist PC-1 Teil eines Multiproteinkomplexes. Weiters konnte gezeigt werden, dass einige Proteine in unterschiedlichem Ausmaß mit den beiden PC-1 Varianten assoziieren. Eine Gruppe von Proteinen (GRP78, eIF-2[alpha]) spielt im Signalweg von Entzündung eine wichtige Rolle, der in anderen Studien bereits in Verbindung mit Insulinresistenz gebracht wurde.<br />Möglicherweise bildet PC-1 einen Angelpunkt zwischen diesen zwei Signalwegen (Entzündung und Insulinresistenz), der durch die Identifikation dieser assoziierter Proteine bekräftigt werden könnte.<br />

Plasma cell glycoprotein 1 (PC-1) overexpression and the polymorphism K173Q variant in the PC-1 gene have been associated with insulin resistance. The mode of interaction of PC-1 in insulin resistance is not known. It is essential to understand the affected signaling pathway to understand the insulin resistance and consequently avoid it.<br />In the present study a proteomic approach was chosen to find probable PC-1 binding partners which might help to get to know how PC-1 is embedded in the insulin signaling pathway. Proteins binding to PC-1 wildtype (wt) as well as to PC-1 with the polymorphism K173Q (mut) were immunoprecipitated with a specific antibody directed to PC-1 and subsequently subjected to 2-dimensional difference gel electrophoresis (DIGE). PC-1 has been reported to interact with the protein insulin receptor [alpha]-chain and thus the co-precipitation of PC-1 associated proteins may enlighten the connection of PC-1 to the insulin signaling pathway. The relative quantitation of proteins was evaluated by DIGE experiments with Cy-dyes. The preliminary identification of the proteins found in association with PC-1 was carried out with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MS) and subsequent comparison of the gained tryptic fingerprints of the interesting proteins in data bases. To confirm the findings of the data base research MS/MS-experiments were performed of the tryptic fragments that led mostly to sequence tags of the peptides. High-energy collision induced decay (HE CID) as well as post source decay (PSD) were used for fragmentation of the peptides. The first experiments were constrained to qualitative observations of PC-1 wt and PC-1 mut binding partners on 2-dimensional silver-stained gels. 12 proteins could be assigned to PC-1, namely vimentin (VIM), tropomyosin 3 (TPM3), drebrin 1 (DREB), alpha-actinin (ACTN4), eukaryotic translation initiation factor 2 alpha-subunit (eIF-2[alpha]), elongation factor 2 (EF-2), 60 S acidic ribosomal protein P0 (RPLP0), 78 kD glucose-regulated protein (GRP78, BiP), T-complex protein 1, epsilon subunit (TCPE), phosphoribosylaminoimidazole carboxylase (ADE2), valosin-containing protein (VCP) and receptor activated protein kinase 1 (RACK1). Three of them were exclusively found in interaction with PC-1 wt (VIM, ACTN4 and VCP) and one with PC-1 mut (GRP78). Those identifications are not just based on tryptic fingerprints of MALDI MS analysis but also on sequence tags which is esteemed as "state of the art". The fluorescence labeling (DIGE) enabled a relative quantitation of proteins and thus information about their expression. The comparison of the total cell lysates of PC-1 wt and mut showed three proteins altered in their expression namely 60 kDa heat shock protein heat-shock protein 60-kD (HSP60), protein disulfide isomerase A3 (PDI A3) and actin-regulatory protein (CAP-G). One of them was also detected in the immunoprecipitates (IPs), the protein PDI A3. 11 differently regulated proteins were found in the IPs differently associated to PC-1 which occurred not until reducing ubiquitous proteins as serum albumin. Those were the following: F-actin capping protein, subunit alpha-2 (CapZ [alpha]-2), eukaryotic translation elongation factor 1 gamma (EEF1G), 34/67 kDa laminin binding receptor 1 (LAMR1), T-complex protein 1, beta subunit (TCPB), PDI A3, PDI A6, thioredoxin-like protein 2 (TXNL2), GAIP interacting protein 1 (GIPC1), serine/threonine-protein kinase (MARK2, EMK1), annexin 2 (ANXA2) and ATP synthase H+ transporting mitochondrial F1 complex beta subunit (ATP5B). Surprisingly, the proteins of the two different experiments (2D silver stained gels and the DIGE gels) did not yield a single match. Thus, an independent biological method was chosen to verify the findings, Western blot analysis. The verification of the identified proteins failed in the Western blot analysis made with several commercial antibodies. Although we were not able to verify any protein by Western blot analysis, still ANXA2 has been reported in previous studies to interact with PC-1 in the mineralization process. A basic difference between the experiments (silver staining and DIGE) in combination with MS and Western blot analysis were the used culture cells that were not of the same origin. That may be a reason for the different protein pattern. As far as can be assessed by that study PC-1 is part of a multiprotein-complex. Furthermore it could be demonstrated that there are proteins associating with PC-1, even in a different extent to PC-1 wt as to PC-1 mut. A group of the found proteins (GRP78, eIF-2[alpha]) play a role in inflammation that was linked to insulin resistance in other studies. Thus there might be a bridge from the inflammatory pathway to insulin resistance over PC-1 and the found proteins in that study.<br />