Heterologous expression of the thermostable cellulase CEL45A in trichoderma reesei

Abstract

Since its discovery the fungus Trichoderma reesei is known for its cellulases and therefore for its ability to degrade cellulose. The filamentous ascomycete T. reesei is used as expression host for the industrial production of cellulases during the last 30 years. Through mutation and selection strains were generated that are able to produce considerable amounts of cellulases. Based on the development of different molecular tools a great step forward in recombinant strain construction for heterologous production of cellulases could be achieved. There is a great interest especially in producing thermostable cellulases, to hy-drolyse lignocellulose with higher yields. The aim of this work was to express a thermostable cellulase in T. reesei. For this purpose, the coding region of the cel45a cellulase was cloned under the homologous cellobiohydrolase 1 expres-sion signals. The expression cassette was transformed through electroporation into the T. reesei wild type strain QM6a and the strong cellulase producer T. reesei Rut C30. To produce CEL45A selected transformants were cultivated on cellulose as inducing C-source. In the supernatant of the transformants of both parental strains a 37 kDa protein was secreted which was identified as CEL45A through MS-MS. Cel45a transformants showed a general increased endoglucanase activity and the expressed cellulase showed an increased thermostability at 60°C. In summary, it could be shown within this work, that CEL45A could be produced functionally active and thermostable with the host T. reesei.

Seit seiner Entdeckung ist der Pilz Trichoderma reesei für seine Cellulasen, und damit zusammenhängend dem Abbau von Cellulose bekannt. Der filamentöse Schimmelpilz T. reesei wird seit 30 Jahren in der industriellen Produktion von verschiedenen Cellulasen als Expressionshost verwendet. Durch Mutagenese und Selektion wurden T. reesei Stämme entwickelt, die beachtliche Cellulasemengen bilden können und durch die Implementierung molekularer Werkzeuge wurden auch beachtliche Erfolge in der Produktion heterologer Cellulasen erzielt. Großes Interesse besteht v.a. in der Produktion thermostabiler Cellulasen, um Lignocellulose mit höheren Reaktionsraten zu fermentierbaren Zuckern umzuwandeln. Das Ziel dieser Arbeit war es eine thermostabile Cellulase in T. reesei zu exprimieren. Dazu wurde die kodierende Region der cel45a Cellulase unter den homologen Cellobiohydrolase 1 Expressionssignalen von T. reesei kloniert. Die Expressionskassette wurde mittels Elektroporation in den T. reesei Wildstamm QM6a und den stark Cellulasen produzierenden Stamm Rut C30 eingebracht. Zur Produktion von CEL45A wurden ausgewählte Transformanten auf Cellulose als induzierenden C-Quelle angezüchtet. Im Überstand der Trans-formanten beider Ausgangsstämme wurde ein 37 kDa Protein gebildet, das mit-tels MS-MS als CEL45A identifiziert wurde. Cel45a Transformanten zeigten eine allgemein erhöhte Endoglucanaseaktivität und die gebildete Cellulase zeigte bei 60 °C erhöhte Thermostabilität. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass CEL45A funktionell aktiv und thermostabil in T. reesei exprimiert wird.