Investigation of the mannitol metabolism in Aureobasidium pullulans through CRISPR/Cas9 mediated mutagenesis

Abstract

Mannitol is a polyol with application as sugar substitute and as excipient and drug in the pharmaceutical industry. It is found ubiquitously in fungi. However, the exact mechanisms of mannitol metabolism have yet to be determined. A possible metabolic route for mannitol in fungi was proposed by Hult and Gatenbeck in 1978. Mannitol-1-phosphate 5-dehydrogenase (Mpdh) was identified as the main enzyme responsible for mannitol synthesis, and mannitol 2-dehydrogenase (Mdh) as the main mannitol degradation enzyme. The main goal of this thesis was the investigation of the mannitol metabolism in Aureobasidium pullulans, a fungus with ubiquitous environmental occurrence and importance for biotechnological exploitation in the pharmaceutical and food industry. In this work, the putative genes coding for Mdh and Mpdh were successfully disrupted in A. pullulans using genetic engineering. Different genetic engineering strategies were tested: the use of a plasmid for in vivo synthesis of sgRNA and Cas9 for disruption of a gene resulted in a high number of transformants (~60 CFU/μg DNA) along with a high likelihood for a knock-out of the targeted gene (>90 %). The integration of a marker gene via homology directed repair was tested using repair DNA of either 20 or 500 bp length of homology. The additional introduction of preassembled ribonucleoproteins (RNPs), consisting of sgRNA and Cas9 for inducing a double-strand break, along with the repair DNA, lead to a 10-120-fold increase of CFUs. The obtained MDH disrupted and the MDH/MPDH double disrupted strains of A. pullulans were cultivated on medium containing either glucose, fructose or mannitol as carbon source. It could be shown that both strains can still break down and produce mannitol; mannitol consumption, however, was decreased for both strains compared to the wildtype. Quantification of intracellular mannitol revealed a decrease for the ΔMPDH and ΔMDHΔMPDH strain when grown on glucose as carbon source, disruption of the MDH gene resulted in an accumulation of intracellular mannitol for cells grown on fructose as carbon source. The simple model of the mannitol cycle was disproven, more genes than the two targeted ones are involved.

Das Polyol Mannitol findet Anwendung als Zuckerersatzstoff und Arzneimittel. In Pilzen ist Mannitol allgegenwärtig, trotzdem ist der genaue Mechanismus des Mannitolstoffwechsels nach wie vor nicht aufgeklärt. Ein möglicher Stoffwechselweg wurde 1978 von Hult und Gatenbeck vorgeschlagen: als Hauptenzym für den Mannitolaufbau wurde Mannitol-1-Phosphat 5-Dehydrogenase (Mpdh) identifiziert, während Mannitol 2-Dehydrogenase (Mdh) für den Mannitolabbau zuständig ist. Das Ziel dieser Diplomarbeit war die Untersuchung des Mannitolmetabolismus in Aureobasidium pullulans, einem weitverbreitet vorkommenden Pilz mit biotechnologischer Bedeutung für die Lebensmittel- und pharmazeutische Industrie. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden die mutmaßlichen Gene für Mdh und Mpdh in A. pullulans erfolgreich ausgeschalten. Verschiedene Genomeditierungsstrategien wurden getestet: einerseits wurde ein Plasmid zur in-vivo Synthese von sgRNA und Cas9 zum Ausschalten eines Gens erfolgreich eingesetzt. Die resultierende hohe Anzahl an Transformanten (~60 KBE/μg DNA) und die hohe Wahrscheinlichkeit für eine Ausschaltung des Zielgens (>90%) machen diesen Ansatz attraktiv für künftige Anwendungen. Anderseits wurde die Integration eines Markergens mittels homologer Rekombination mit einer Homologielänge von 20 und 500 bp getestet. Der zusätzliche Einsatz von Ribonukleoproteinen, bestehend aus sgRNA und Cas9 zur Erzeugung eines DNA-Doppelstrangbruches, führte zu einem 10- bis 120-fachen Anstieg an koloniebildenden Einheiten. Die generierten MDH und MDH/MPDH knock-out Stämme wurden in Medium mit Glukose, Fruktose und Mannitol als Kohlenstoffquelle kultiviert. Es konnte gezeigt werden, dass die Fähigkeit zum Mannitolaufbau und -abbau in diesen Stämmen nicht verloren ging, die Mannitolverwendung im Vergleich zum Wildtyp jedoch reduziert war. Wenn Glukose als Kohlenstoffquelle eingesetzt wurde, war für die Stämme ΔMPDH und ΔMDHΔMPDH die intrazelluläre Mannitolkonzentration niedriger als im Wildtyp. Die Ausschaltung des MDH-Gens führte zu einer erhöhten intrazellulären Mannitolkonzentration, wenn Fruktose als C-Quelle verwendet wurde. Diese Ergebnisse können mit dem einfachen zyklischen Modell für den Mannitolmetabolismus nicht erklärt werden. Weitere Gene, zusätzlich zu den beiden, die ausgeschalten wurden, sind involviert.