Microfluidic system for collection of extracellular vesicles from tumor spheroids

Abstract

Krebs ist eine heterogene und dynamische Krankheit, bei der die molekularen und zellulären Interaktionen als Reaktion auf die Tumormikroumgebung ständig neu gestaltet werden [1]. Die Hauptbestandteile der Tumormikroumgebung sind die Tumorzellen, die Stromazellen und die von ihnen produzierte extrazelluläre Matrix. Außerdem weist die Tumormikroumgebung physikalische und chemische Merkmale auf. Zu verstehen, wie die verschiedenen Komponenten der Tumormikroumgebung interagieren, ist in der Krebsforschung sehr wichtig. Von Tumorzellen abgeleitete Exosome spielen eine entscheidende Rolle bei der Umgestaltung der Tumormikroumgebung. Sie sind auch am Tumormetastasierungsprozess beteiligt und werden als Mediatoren der Krebstherapieresistenz beschrieben [2]. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde ein mikrofluidisches System für Sphäroide hergestellt, um den Tumor und einige der Merkmale der Tumormikroumgebung bei Darmkrebs bestmöglich nachzuahmen. Darüber hinaus wurde ein Protokoll erstellt, um extrazelluläre Vesikel wie Exosome aus den generierten Krebsmodellen auf dem Chip zu isolieren und nachzuweisen. Die Tumorsphäroide wurden aus der kolorektalen Zelllinie Caco-2 gebildet und in den Mikrokanälen des Chips eingeschlossen, um extrazelluläre Vesikel zu sammeln. Für das mikrofluidische Gerät lag der Fokus auf der Auswahl eines kompatiblen Maskendesigns, das durch Simulation des Strömungsgeschwindigkeitsprofils bestätigt wurde. Der SU-8-Master wurde im Reinraum mittels Photolithografie erstellt und zur Herstellung eines PDMS-Stempels verwendet, der mit einer PDMS-Folie durch Plasmabonden versiegelt wurde. Um das Einführen von Sphäroiden in das mikrofluidische System zu vereinfachen, wurde ein Konnektor am Eingang und Ausgang des Mikrochips befestigt. Dann wurden die optimalen Strömungsbedingungen bestimmt, um die Sphäroide im Inneren des Chips einzufangen und zu kultivieren. Schließlich wurden die Exosome nach 48, 54 und 72 Stunden in Kultur aus Sphäroiden für weitere mögliche Downstream-Anwendungen extrahiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit bieten eine kostengünstige und benutzerfreundliche Möglichkeit, Sphäroide in mikrofluidischen Geräten einzufangen und die Isolierung von Exosomen unter physiologischen Bedingungen zu beschleunigen. Das generierte System könnte angewendet werden, um die Wirkung der Tumorzusammensetzung und der Tumormikroumgebung in der Exosomenladung zu untersuchen. Dies könnte wichtige Auswirkungen auf die Untersuchung der Biologie von Exosomen und ihrer Rolle bei Krebs haben.

Cancer is a heterogeneous and dynamic disease, in which the molecular and cellular interactions are constantly reshaped in response to the tumoral microenvironment (TME). The main components of the TME are the tumoral cells, the stromal cells, and the extracellular matrix (ECM), which is produced by them. Also, the TME presents physical and chemical features. To understand how the different components of the TME interact, is very important in cancer research. Tumor cell-derived exosomes play a vital role in the remodeling of the tumor microenvironment. They are also involved in the tumoral metastatic process and were reported to be mediators of cancer therapy resistance [2]. In the scope of this thesis, a microfluidic spheroid on a chip system was fabricated to best mimic the tumor and some of the TME features in colorectal cancer (CRC). Furthermore, a protocol was set up to isolate and detect extracellular vesicles, such as exosomes, from the generated cancer models on chip. The tumor spheroids have been formed from the colorectal cell line Caco-2 and trapped in the microchannels of the chip to collect extracellular vesicles. For the microfluidic device, the focus was put on choosing a compatible mask design, which was approved by simulating the flow velocity profile. The SU-8 master was created in the clean room by photolithography and was used for the fabrication of a PDMS stamp, which was sealed with a PDMS square by plasma bonding. To simplify the seeding procedure of spheroids into the microfluidic system, a connector was attached to the inlet and outlet of the microchip with an adhesive sheet. Then, the optimal flow conditions were determined to trap and cultivate the spheroids inside the chip. Finally, the exosomes were extracted from spheroids for further possible downstream applications at 48, 54 and 72 hours in culture. The results of this thesis offer an inexpensive and user-friendly possibility to trap spheroids inside microfluidic devices and to expedite the isolation of exosomes under more physiological conditions. The generated system could be applied to study the effect of the tumor composition and surrounding microenvironment in the exosomes cargo. This could have important repercussion in the study of the exosome biology and their role in cancer.