Functional characterization of putative interactors of the Trichoderma atroviride Gpr1 7- TM receptor

Abstract

Der Einsatz von chemischen Fungiziden gegen bodenbürtige Pathogene geht fast immer Hand in Hand mit einer Fülle negativer Effekte. Im Gegensatz dazu ist der Einsatz von Mikroorganismen, die Pflanzenpathogenen entgegenwirken eine umweltfreundliche, nachhaltige und daher vielversprechende Alternative zu den oben genannten. Unter diesen erfolgreichen Antagonisten, die auch unter dem Namen Biokontrollagenzien bekannt sind, sind Spezies der Pilzgattung Trichoderma.<br />Aufgrund ihres Erfolgs in der Biokontrolle stehen diese Pilze im Zentrum detaillierter Studien. Es wurde beobachtet, dass der membranständige Rezeptor Gpr1 von Trichoderma atroviride in der antagonistischen Interaktion von T. atroviride mit Wirtspilzen essentiell ist, da er eine maßgebliche Rolle in der Wirtserkennung und in Prozessen, die mit Mykoparasitismus in Verbindung gebracht werden, spielt. Zudem führte das Abrastern einer T. atroviride cDNA Bibliothek zur Identifizierung von mehreren Proteinen, die möglicherweise mit dem Gpr1 Rezeptor interagieren.<br />Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Fokus auf die funktionelle Charakterisierung der Gene ID 156007 und ID 318674, die für zwei dieser möglichen Gpr1 Interaktoren kodieren, gelegt.<br />Nach der Herstellung von Deletions- und Überexpressionsmutanten wurden deren Phänotypen, mit besonderem Augenmerk auf generelle Wachstumseigenschaften und die mykoparasitische Aktivität, charakterisiert. Deletionsmutante ∆15 zeigte permanente Sporulation, auch in Dunkelheit und produzierte dunkelgrüne und kristalline Sporen, während die anderen Mutanten, ähnlich dem T.<br />atroviride Wildtyp- Stamm, nur durch Lichtstimulation sporulierten.<br />Außerdem fehlten Mutante ∆15 Lufthyphen, stattdessen zeigte diese submerses Wachstum in den Agar und vermehrte Hyphenverzweigungen. In Mutante ∆15 wurde, im Vergleich zum Wildtyp, auch eine reduzierte Sporenkeimung und die Produktion kürzere Keimschläuche beobachtet. Mutanten, die eines der beiden Gene überexprimierten, wurden ebenfalls untersucht und wiesen zusammen mit Mutante ∆31 im Vergleich zum Wildtyp, erhöhte Wachstumsraten auf festem Medium auf, währenddessen das Wachstum von Mutante ∆15 unter diesen Bedingungen signifikant reduziert war. Im Gegensatz dazu steht die Biomasseproduktion bei Kultivierung in Flüssigmedium: Diese ist in Mutante ∆31 reduziert, in Mutante ∆15 ähnlich jener des Wildtyps und in den Überexpressionsmutanten erhöht.<br />Während der Konfrontation mit den pilzlichen Pflanzenpathogenen Rhizoctonia solani und Botrytis cinerea zeigten alle Stämme, außer Mutante ∆15, welcher avirulent war, das typische mykoparasitische Verhalten, welches in Überwachsen und Abtöten des Wirtspilzes resultiert. In einer detaillierten Analyse wurden in Konfrontation mit R. solani erhöhte Expressionsniveaus von prb1, einem für den Mykoparasitismus relevanten Gen, in der Überexpressionsmutante OEX31 beobachtet, währenddessen bei Mutante ∆15 im Vergleich zum Wildtyp eine signifikant erhöhte Transkription des Gens ech42, welches ebenfalls mit Mykoparasitismus in Verbindung gebracht wird, nachgewiesen werden konnte.<br />

The use of chemical fungicides against soil- borne pathogens almost always comes with a plethora of negative side- effects. In contrast, using microorganisms that antagonize plant pathogens is environmentally friendly and sustainable and therefore became a promising alternative to the above mentioned. Among those successful antagonizers, also known as biocontrol- agents (BCAs), are species of the fungal genus Trichoderma. Due to their success in biocontrol, these fungi have already been studied in detail. So, it was found that the T. atroviride seven- transmembrane Gpr1 receptor is essential in the antagonistic interaction of T. atroviride with host fungi thereby governing host recognition and mycoparasitism-related processes. Furthermore, screening of a T.<br />atroviride cDNA library led to the identification of several putative Gpr1 - interacting proteins In the scope of this thesis, focus was placed on the functional characterization of genes ID 156007 and ID 318674 encoding two of these putative Gpr1 interactors. After generation of mutants bearing deletions or overexpressions of the respective genes, phenotypic characterization was carried out regarding general growth properties and mycoparasitic activity. Deletion mutant ∆15 showed permanent conidiation, also in darkness, by producing dark- green and crystalline spores while the other mutants conidiated upon stimulation with light similar to the wild- type. Furthermore mutant ∆15 lacked aerial hyphae but instead showed submerged growth into the agar and enhanced hyphal branching. Mutant ∆15 also showed reduced conidial germination and produced shorter germ tubes than the wild- type. Mutants overexpressing either of the two genes tested and mutant ∆31 had enhanced growth rates on solid media compared to the wild- type, whereas growth of mutant ∆15 was significantly reduced under this condition. In contrast, analysis of biomass formation upon cultivation in liquid media revealed reduced biomass production of mutant ∆31, biomass production similar to the wild- type for mutant ∆15 and enhanced biomass formation of the overexpression mutants.<br />During confrontation with the fungal phytopathogens R. solani and B.<br />cinerea, all strains, except mutant ∆15 which was avirulent, showed the typical mycoparasitic behavior resulting in overgrowth and killing of the host fungus. Detailed analysis revealed enhanced expression levels of the mycoparasitism- related prb1gene in overexpression mutant OEX31 upon confrontation with R. solani while mutant ∆15 showed a significantly enhanced transcription of mycoparasitism- related ech42 gene compared to the wild- type.