Science-based bioprocess design for filamentous fungi : novel tools for efficient morphological and physiological bioprocess characterization

Abstract

Organische Säuren, Enzyme oder Antibiotika sind Beispiele für die Vielzahl von wirtschaftlich relevanten Fermentationsprodukten, welche im industriellen Maßstab mittels filamentöser Pilze hergestellt werden. Zur Entwicklung dieser Bioprozesse werden aufgrund eines komplexen Zusammenspiels zwischen Prozessparametern, Produktausbeute, Physiologie und Morphologie üblicherweise erfahrungsbasierte Methoden herangezogen. Da es derartigen empirischen Ansätzen jedoch an wissenschaftlichem Prozessverständnis fehlt, resultieren sie unweigerlich in suboptimalen Bioprozessen sowie hohen Prozessausfallsraten.<br />Die vorliegende Dissertation verfolgt das Ziel von wissenschaftlich begründeter Bioprozessentwicklung und präsentiert neue Methoden für die schnelle und effiziente morphologische und physiologische Bioprozesscharakterisierung. Grundprinzipienbasierende Massenbilanzierung zur statistisch verifizierten Quantifizierung von stöchiometrischen Konversionsraten erlaubte die bis dato nicht mögliche schnelle Bestimmung von physiologischen Wachstumskinetiken auf komplexen, unlöslichen Medien. Überdies stellt die Arbeit eine neue Methode zur schnellen Quantifizierung der komplexen filamentösen Morphologie vor. Vorteile des neuentwickelten Ansatzes sind die automatisierte, lichtmikroskopische Analyse von mehr als 10.000 individuellen Biomasseobjekten pro Einzelprobe, wodurch eine statistisch verifizierte Bestimmung der morphologischen Gesamtheterogenität in einem einzigen Arbeitsschritt ermöglicht wurde. MALDI-TOF Massenspektrometrie an intakten Zellen sowie FTIR Spektromikroskopie wurden als neue, leistungsfähige Instrumente für die molekulare sowie ortsaufgelöste Analyse von filamentöser Mikromorphologie vorgestellt.<br />Echtzeitüberwachung des morphologischen Prozessverhaltens wurde anhand von dielektrischer Spektroskopie demonstriert. Schlussendlich wurden zum ersten Mal multivariate Zusammenhänge zwischen Bioprozessparametern, Morphologie und Physiologie in einem Mehrphasenzulaufverfahren charakterisiert, quantifiziert und mechanistisch beschrieben.<br />Die vorgestellte Methodologie stellt ein wertvolles Instrument für die wissenschaftsbasierte Bioprozessentwicklung und die Aufklärung von mechanistischen Zusammenhängen zwischen Prozesstechnologie, Stammcharakteristika und Prozessperformanz dar. In Verbindung mit mechanistischer Prozessmodellierung erlaubten die vorgeschlagenen Methoden zur Bioprozesscharakterisierung nicht nur schnelle und effiziente morphologische und physiologische Prozesscharakterisierung sondern verfolgen auch das Ziel der Ergebnistransferierbarkeit sowie der Anwendbarkeit auf den Prozess n+1 und den Stamm n+1.<br />

Filamentous fungi are widely employed for the large scale production of organic acids, enzymes, antibiotics as well as further value-added products. Due to intertwined interdependencies between process parameters, process performance, physiology and complex growth morphology, traditional bioprocess design for filamentous fungi is commonly based on empirical approaches. Empirical approaches, however, lack scientific process understanding and inevitably lead to sub-optimally designed bioprocesses and high process failure rates.<br />Aiming at science-based bioprocess design, this thesis introduces a toolbox of novel methods for fast and efficient morphological and physiological bioprocess characterization. Statistically verified quantification of stoichiometric conversion rates based on 1st principle mass balancing facilitated fast resolution of physiological growth kinetics on chemically undefined insoluble media for the first time.<br />Moreover, a novel method for fast quantification of complex filamentous growth morphology was introduced. Novelties of the presented approach include the automated high-throughput light-microscopic analysis of up to more than 10,000 individual biomass objects per sample, which enabled statistically verified quantification of the entire morphological heterogeneity in a single step. Additionally, MALDI-TOF intact cell mass spectrometry and FTIR spectromicroscopy were introduced as novel, powerful tools for molecular analysis and spatial resolution of fungal micromorphology. In-line real-time morphological monitoring was further demonstrated by dielectric spectroscopy. Finally, multivariate interdependencies between bioprocess parameters, morphology and physiology were characterized, quantified and mechanistically described in a multi-stage fed-batch production process for the first time.<br />Paving the way towards science-based bioprocess design, the proposed methodologies represent valuable tools for the elucidation of mechanistic interrelations between process technology, strain characteristics and process performance. Generic qualities of suggested bioprocess characterization approaches together with mechanistic process modeling procedures not only enabled efficient morphological and physiological bioprocess characterization but also target at facilitating transferability of results, and, method applicability to process n+1 and strain n+1.