Polyphenolstoffwechsel in Apfel

Abstract

Im Rahmen des Interreg-Projekts "Gemeinsam gegen Feuerbrand" wurden sieben Sorten ausgewählt, von denen angenommen wird, dass sie tolerant gegen Feuerbrand sind. In früheren enzymatischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass geringe Enzymaktivitäten der Flavonoid 3-O-glucosyltransferase (F3GT), der Dihydrochalcon 2'-O-glucosyltransferase (PGT) und der Flavonolsynthase (FLS) charakteristisch für tolerante Apfelsorten sind. Als Kontrollprobe wurde die Sorte Rewena mit getestet, von der bekannt ist, dass sie gegenüber der Pflanzenkrankheit Feuerbrand tolerant ist. Nur die Sorte Wellant hat bei den Schlüsselenzymen ähnlich niedrige oder niedrigere Werte als Rewena. Die Sorte Mitch-Gala zeigt die höchsten Enzymaktivitäten und sollte daher anfällig gegen Feuerbrand sein. Diese Annahmen müssen noch durch Feuerbrandtests bestätigt werden.<br />Außerdem wurde die an der Phloridzin-Biosynthese beteiligte Glucosyltransferase UGT71A15 näher charakterisiert und ihre mögliche Beteiligung an der Feuerbrandresistenz untersucht. Zu diesem Zweck wurde das Strukturgen dieser Glucosyltransferase in Malus robusta 5 überexprimiert und die transgenen Pflanzen hinsichtlich ihrer Enzymaktivität sowie ihrer Feuerbrandanfälligkeit untersucht. Darüber hinaus wurde geprüft, ob eine Beeinflussung der anderen an der Flavonoid-Biosynthese beteiligten Enzyme in den transgenen Pflanzen erfolgt.<br />Es konnte gezeigt werden, dass die Glucosyltransferase nicht nur Phloretin sondern auch eine Reihe anderer Flavonoide glucosylieren kann. Die besten Umsatzraten wurden mit den Flavonolen Kämpferol und Quercetin erzielt, während die Flavanone Naringenin und Eriodictyol sowie deren Chalcone wesentlich schlechter umgesetzt wurden. Die im Apfel natürlich nicht vorkommenden 6'-Deoxychalcone wurden zwar glucosyliert, die Umsatzraten waren aber im Vergleich zu den anderen Substraten sehr gering. Das Flavon Apigenin (4'-OH) wurde von der Glucosyltransferase nicht als Substrat akzeptiert, während das Flavon Luteolin (3',4'-OH) glucosyliert wurde.<br />Die Glucosylierungsreaktion wurde mit den beiden bevorzugten Substraten Kämpferol und Quercetin sowie mit Phloretin im Detail untersucht. Die Bestimmung der Km-Werte ergab für Kämpferol: 46,9 µM, für Quercetin: 16,4 µM, und für Phloretin: 23,0 µM.<br />Damit liegen die ermittelten Km-Werte im durchaus physiologischen Bereich. Das eigentliche Maß der Substratspezifität ist aber nicht der Km-Wert, sondern Vmax/Km. Da die Vmax-Werte jedoch sehr gering sind, ergeben sich sehr geringe Vmax/Km-Werte (Kämpferol: 3*10-3, Quercetin 4*10-3, Phloretin: 1,3*10-3 [L*s-1*kg-1]), was auf eine eher geringe Substratspezifität hinweist.<br />Transgene Apfelbäumchen wurden hergestellt, bei denen die Glucosyltransferase UGT71A15 überexprimiert wurde. Als Ausgangslinie wurde Malus robusta 5 verwendet.<br />Insgesamt wurden 15 dieser transgenen Pflanzen untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden mit jenen der Ausgangslinie verglichen.<br />Verglichen mit der Kontrollprobe zeigten vier Linien eine erhöhte Glucosyltransferase - Aktivität mit Quercetin als Substrat. Ebenfalls vier der untersuchten Linien zeigten eine erhöhte Enzymaktivität bei Verwendung von Phloretin als Substrat.<br />Interessanterweise gab es keine Korrelation hinsichtlich der Substratspezifität, das heißt es konnte keine Linie gefunden werden, die sowohl mit Quercetin, als auch mit Phloretin als Substrat eine erhöhte Enzymaktivität im Vergleich mit der Kontrollprobe zeigte.<br />Obwohl die transgenen Linien sich nur durch Überexpression der Glucosyltransferase von den Ausgangslinien unterscheiden, konnten zum Teil beachtliche Aktivitätsunterschiede der anderen an der Flavonoidbiosynthese beteiligten Enzyme beobachtet werden.<br />

Within the framework of the Interreg-Project IV "Gemeinsam gegen Feuerbrand", seven varieties assumed to be tolerant against fire blight were chosen. As previous studies showed, the enzymes Flavonoid 3-glucosyltransferase (F3GT), Dihydrochalcone 2'- glucosyltransferase (PGT) and Flavonolsynthase (FLS) show characteristically low activities in tolerant varieties of apple. The tolerant variety ,Rewena' was used as control sample. The variety ,Wellant' shows enzyme activities simliar to ,Rewena' or lower, whereas the variety ,Mitch-gala' shows the highest enzyme activites and therefore should be susceptible to fire blight. These assumptions have to be proven by infection studies.<br />In addition, the glucosyltransferase UGT71A15, which is able to glucosylate phloretin, was characterized with respect to its possible influence on resistance to fire blight. Therefore, the cDNA-clone was overexpressed in Malus robusta 5. The enzyme activities of the modified plants were tested, as were the plants for their susceptibility to fire blight.<br />The influence on the other enzymes of the flavonoid-pathway were tested as well.<br />Glucosyltransferase was shown to be able to glucosylate not only phloretin, but also at least nine other flavonoids. The flavonols kaempferol and quercetin showed the highest conversion rate with the glucosyltransferase. The flavanons naringenin, eriodictyol and their chalcones were glucosylated less effective. Compared to the other substrates the conversion rates of the 6- deocychalcones were very low, although glucosylation could be observed.<br />The glucosyltransferase was not able to use apigenin as a substrate, whereas luteolin was glucosylated.<br />Glucosylation with the most preferred substrates kaempferol and quercetin was investigated in more detail, as was with phloretin. The determination of the Km-values led to the following results:<br />kaempferol 46.9 µM, quercetin 16.4 µM, and phloretin: 23.0 µM. These values are within physiological range. Substrate specifity is qualified by using Vmax/Km instead of Km. The values of Vmax are very low. This results in low Vmax/Km values (Kaempferol:<br />3*10-3, Quercetin 4*10-3, Phloretin: 1,3*10-3 [L*s-1*kg-1]) and indicates poor substrate specifity.<br />Genetically modified lines overexpressing the glucosyltransferase UGT71A15 were produced.<br />Malus robusta 5 was the parental plant and also the control sample. 15 transgenic plants were tested and the results compared to the control sample.<br />In relation to the control sample, four of the tested lines showed increased glucosyltransferase activity with quercetin as used substrate. For four other lines, increased enzymatic activity with phloretin as used substrate was observed. No line was found with both, increased activity with phloretin and quercetin.<br />Remarkable differences in activity of the enzymes part of the flavonoid pathway could be observed in all lines, although the lines differed in overexpression of the glucosyltransferase only.<br />