Chromatin rearrangement analysis in of Xyr1 regulon genes in Trichoderma reesei

Abstract

Der filamentöse Pilz Trichoderma reesei (T. reesei) wird in der Industrie für verschiedene Anwendungen eingesetzt, was ihm seine hohe sekretorische Kapazität an Zellulose und Hemizellulose abbauenden Enzymen ermöglicht. Es gibt bereits sehr gute Studien, die sich mit der transkriptionellen Regulation von Xyr1 kontrollierten Genen beschäftigen, die unter anderem eine Katabolitrepression durch Cre1 vermittelt und die Identifizierung von Transkriptionsfaktoren (Ace1, Ace2, Hap2/3/5, ein möglicher Repressor Xpp1) beinhalten. Dennoch ist noch sehr wenig über eine Chromatin basierende Genregulation bekannt, die sich aus strukturellen Änderungen in der Chromatinstruktur und ihrer Dynamik ergeben. Sowohl "upstream" regulierende Bereiche als auch essentielle Promotorelemente (Transkriptionsstartstelle, TATA-Box) der industriell genutzten T. reesei Stämme Rut-C30, BTR213 und eine degenerierte Version BTR213 (cel-), ohne jegliche relevante Enzymproduktion, wurden unter induzierenden und reprimierenden Bedingungen untersucht. Zum ersten Mal wurde eine Methode etabliert, die Chromatinumstrukturierungen in Xyr1 kontrollierten Genen in dem Pilz T.<br />reesei erfasst. Dabei werden Enzymverdaue mit DNase I und MNase, die die Zugänglichkeit der DNA simulieren sollen, angewendet und eine quantititative Aussage mittels real-time PCR über die Veränderung der Chromatinstruktur gemacht (CHART-PCR). Die Auswertung der RT-PCR Ergebnisse wird in einem dimensionslosen Index (RAI) zusammengefasst, der eine Relation zwischen zugänglicher und nicht zugänglicher DNA setzt. Außerdem werden die Indizes einem statistischen Test unterzogen, um signifikante Unterschiede zu verschiedenen Wachstumsbedingungen des Pilzes und Pilzstämmen zu sehen. Für den Industriestamm Rut-C30 wurde eine höhere Chromatindynamik für die Genen cbh1, cbh2, xyn1 und xyn2 in Anwesenheit des Induktors Sophorose gezeigt. Der degenerierte Stamm BTR213(cel-), zeigte mäßige Transkripte der Gene cbh1 und cbh2 sowie einen Verlust der spezifischen Umstrukturierung aufgrund von Sophorose.<br />Im Gegenstatz dazu wurden für xyn2 hohe Transkriptmengen gemessen und eine damit verbundene lockere (weniger dynamisch) Chromatinarchitektur.<br />Die Umstellung zwischen hoher und niedriger Zellulaseproduktion ist unter anderem durch die Chromatinstruktur gegeben. In der Industrie ist man immer mehr mit spontaner Stammdegeneration konfrontiert, die nicht zwingend auf Veränderungen in der DNA Sequenz basiert. Diese Methode stellt ein Werkzeug dar, um Chromatin basierende Erklärungen von Genregulation zu finden, die sich als Konsequenz eines epigenetischen Ereignisses darstellen können.<br />

Trichoderma reesei is a filamentous ascomycete of various industrial applications because of its high secretory capacity of hemicellulases and cellulases. Besides already well-studied transcriptional regulation of Xyr1 regulon genes, including as well a carbon catabolite repression mediated by Cre1 and associated transcription factors (Ace1, Ace2, Hap2/3/5, putative repressor Xpp1), hardly anything is known about chromatin-dependent regulation due to rearrangement dynamics. The upstream regulatory region as well as core promoter elements (transcription start sites, TATA box) of industrial strains Rut-C30, BTR213 and a degenerated version BTR213(cel-) were subjects of investigations and were grown under inducing (0.5 mM D-xylose, 2mM [alpha]-sophorose) and repressing conditions (1% D-glucose). For the first time, a quantitative method was established to monitor chromatin rearrangements of genes under control of Xyr1 in T.<br />reesei. The approach exploits DNase I and MNase digestions to imitate chromatin accessibility and quantification of chromatin alterations analyzed by real-time polymerase chain reaction (CHART-PCR). An validation of quantitative PCR analysis was realized in a relative accessibility index (RAI) and employment of statistical tests in order to detect significant differences in chromatin rearrangements. For the hypercellulolytic mutant Rut-C30 a more dynamic chromatin structure was observed under influence of the inducer [alpha]-sophorose for cellulase, cbh1 and cbh2, and xylanase encoding genes, xyn1 and xyn2 respectively.<br />The degenerated strain BTR213(cel-) seemed to lose that specific [alpha]-sophorose chromatin remodeling effect resulting in low expression of cbh1 and cbh2, but enhanced xyn2 gene expression is connected to less pronounced chromatin dynamics. Since spontaneous strain degenerations are not necessarily an issue of alterations in DNA sequence, this method states a tool for elucidation of chromatin-dependent gene regulation and subsequently a consequence of epigenetic traits.