Analysis of blood coagulation factors (Factor VIII and von Willebrand Factor) in their native and PEGylated form by means of MALDI-TOF-MS, CGE-on-a-chip, nES GEMMA and AFM

Abstract

Der Schwerpunkt dieser Dissertation liegt in der Analyse von rekombinanten Blutgerinnungsfaktoren - Faktor VIII (rFVIII) und von Willebrand Faktor (rvWF) - in deren nativer und PEGylierter Form mittels MALDI-TOF-MS (Matrix-unterstützter Laser Desorptions/Ionisations Flugzeit Massenspektrometrie), zweier elektrophoretischer Methoden, nämlich Kapillargelelektrophorese-am-Chip (CGE-on-a-chip), und Nanoelektrospray Gasphasen elektrophoretische Mobilitäts Molekular Analyse (nES-GEMMA), sowie Rasterkraftmikroskopie (AFM). Im Mittelpunkt aller verwendeten Techniken stand die Bestimmung des PEGylierungsgrades und die Ermittlung des exakten Molekulargewichts dieser hochmolekularen Glykoproteine, die zu den größten, und insbesonders FVIII, zu den heterogensten Glykoproteinen überhaupt zählen. Die zusätzliche PEGylierung, welche zu einer Veränderung der pharmakologischen Eigenschaften der Proteine führt, trägt zu einer weiteren strukturellen Heterogenität und dadurch bedingten Herausforderung für die verwendeten analytischen Techniken bei. Die Analyse mittels MALDI-TOF-MS wurde durch die Verwendung eines speziell entworfenen Hochmassendetektors machbar, was zum einen die Bestimmung des PEGylierungsgrades und zum anderen der exakten molekularen Masse ermöglichte. Der Einsatz von CGE-on-a-chip zur Ermittlung des PEGylierungsgrades und des Molekulargewichts wurde ebenfalls getestet. Darüber hinaus wurde zum ersten Mal das nES-GEMMA System für die Analyse von PEGylierten Proteinen verwendet. Die Größenbestimmung der zu messenden Proteine sowie die Zuordnung des Molekulargewichts standen auch hier im Mittelpunkt dieser Technik. Durch eine neu etablierte Korrekturfunktion basierend auf MALDI-TOF-MS Daten war dabei die erfolgreiche Molekulargewichtsbestimmung mittels des eingesetzten nES-GEMMA Instruments möglich. Schließlich wurde auch die so genannte Tapping Mode Methode während der AFM Analyse eingesetzt, um die 3-dimensionale Gestalt des rvWF zu ermitteln. Dabei konnte erstmalig die rekombinante Form mit der aus humanem Plasma abstammenden verglichen werden. Weiters konnte zum ersten Mal das Verhalten von rvWF unter Anwendung von Scherkraft beobachtet werden. nES-GEMMA und MALDI-TOF-MS waren die einzigen Techniken, die eine Messung der dimeren Form von rvWF erlaubten, wobei AFM die einzige Methode war, um auch Informationen über die native, multimere Form des rvWF zu gewinnen.<br />

The focus of this PhD thesis lies in the analysis of recombinant blood coagulation factors - Factor VIII (rFVIII) and von Willebrand Factor (rvWF) - by means of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), two electrophoretic techniques namely capillary gel electrophoresis-on-a-chip (CGE-on-a-chip) and nano electrospray gas phase electrophoretic mobility molecular analysis (nES-GEMMA), as well as atomic force microscopy (AFM). These two glycoproteins belong to the largest and especially rFVIII to the most heterogeneous proteins known. With the coupling of PEG chains, which change the pharmacological properties significantly, the heterogeneity of the recombinant glycoproteins additionally increases and therefore multiplies the requirements of the analytical techniques enormously. The challenge for MALDI-TOF-MS was to measure these high mass glycoproteins in their native and PEGylated forms. For this reason, a novel special designed ultra high mass detector was used.<br />Beside exact molecular weight measurements, the determination of the degree of PEGylation and of the heterogeneity of these very high mass glycoproteins was obtained. The CGE-on-a-chip system was tested for the determination of the molecular weight and the degree of PEGylation.<br />Moreover, two techniques for size determination (GEMMA) and macromolecular visualization (AFM) of the molecules were applied. For the first time, the GEMMA system was used for PEGylated glycoproteins.<br />In this case, average molecular weight and particle size determination of these high molecular weight PEGylated glycoproteins in the gas-phase at atmospheric pressure were obtained successfully. Finally, AFM in the tapping mode was used to visualize the shape and dimensions of rvWF for the first time and compared to human plasma-derived vWF. Furthermore, for the first time, the behaviour of rvWF under high shear stress was monitored by AFM. GEMMA and MALDI-MS allowed the analysis of the dimeric form of rvWF but AFM was the only technique that provided information about rvWF in its multimeric form.