Functional-genomic approaches in the human fungal pathogen Candida glabrata to identify virulence factors

Abstract

In den letzten Jahren gab es einen deutlichen Anstieg invasiver Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten. Diese Infektionen sind in etwa 50 % der Fälle letal, wobei die Mortalitätsrate stark vom Zustand der Patienten abhängt. Der häufigste Stamm bei diesen Infektionen ist Candida albicans, wobei eine Verschiebung zu anderen Candida Stämmen beobachtet wird. Einer dieser Stämme ist Candida glabrata, der ca. 15 - 25 % aller Candidosen verursacht. Anders als C.<br />albicans, ist C. glabrata toleranter gegenüber Antimykotika, die auf Azolen basieren. Da die Standardtherapie mit Azolen erfolgt, stellt dies ein großes Problem dar. Ein weiterer Unterschied zwischen C. glabrata und C. albicans ist dass C. glabrata nicht in der Lage ist echte Hyphen zu formen und auch keine Proteinasen sekretiert. Hyphen und Proteinasen sind jedoch wichtige Faktoren für die Virulenz von C. albicans. Dadurch stellt C. glabrata ein, gegenüber herkömmlichen Behandlungsmethoden, weniger empfindliches Humanpathogen dar, über dessen Virulenzfaktoren nur sehr wenig bekannt ist.<br />In dieser Diplomarbeit soll im Rahmen eines übergeordneten internationalen Projektes, eine Sammlung von C. glabrata Gendeletionsmutanten erstellt werden, bei denen jeweils ein bestimmtes Gen ausgeschaltet wurde. Somit ist es möglich die Funktion eines Genes und auch das Zusammenspiel mit anderen Genen zu untersuchen. Bereits erstellte Gendeletionsmutanten werden zudem auf Resistenz gegen Antimykotika und andere Umwelteinflüsse (Hitze, pH, Immunsystem, ...) in vitro untersucht. Weiters wird mit jeder Gendeletion auch ein molekularer Barcode in das Genom eingebracht, anhand dessen die einzelnen Deletionsstämme voneinander unterschieden werden können.<br />Dadurch wird es möglich sowohl die Fitness als auch die Virulenz mehrerer Gendeletionsmutanten gleichzeitig in vivo, beispielsweise an Mäusen, zu testen. Neben dem Erstellen der Sammlung, sollen im Rahmen dieses Projektes insbesondere auch Deletionsmutanten des SLT2 und des YPK1 Gens untersucht werden. Beide Gene sind Komponenten zweier Signalwege, die die Hefezelle vor Schäden an der Zellwand warnen. Dieser Zellwandstress kann beispielsweise durch Antimykotika, wie Caspofungin hervorgerufen werden. Erste Untersuchungen haben gezeigt, dass die Toleranz von C.<br />glabrata gegenüber Caspofungin, beim Fehlen des SLT2 oder YPK1 Gens drastisch abnimmt. Ziel ist es die beiden Signalwege zu verstehen und bisher unbekannte Bestandteile, oder Quervernetzungen aufzudecken.<br />

Within the last decade, there has been a steady increase of invasive fungal infections in immunocompromised patients. The most common of these infections are caused by Candida spp., which has a high mortality in its disseminated form. C. glabrata (C.g.) now is the second most frequent cause and accounts for 15 - 20 % of all cases of Candidiasis. Importantly, C.g. is more tolerant to antimycotics based on azoles compared to C. albicans (C.a.). This is of clinical importance because of the wide use of azole therapy in fungal infections. Moreover, C.g. is unable to form true hyphae or secrete proteases, which are traditionally important virulence factors of C.a.. This, as well as the tolerance to conventional fungal therapies leaves the nature of virulence factors largely unknown. To identify new virulence and drug resistance factors, we initiated the construction of a genome-scale collection of C.g. deletion mutants. This collection enables studies on the molecular functions of specific genes as well as their interaction with other genes. Hence, we use a reverse genetic approach to generate C.g. gene deletion mutants, which are subsequently analyzed in vitro for their sensitivity to antifungals and different environmental conditions including heat, pH and osmotic stress. Furthermore, each mutant is genetically bar-coded, allowing for the identification of a single strain in a pool of strains in vitro as well in vivo. Preliminary results have highlighted the importance of two genes, the MAP kinase SLT2 and the YPK1 kinase. Both kinases act in parallel or overlapping pathways that are believed to sense and transduce signals arising from cell wall damage as caused by Caspofungin (CF) treatment. Indeed, the tolerance to CF is strongly impaired in slt2∆ or ypk1∆ mutants. We aim to further investigate these pathways to understand the crosstalk between the PKC and the YPK1-mediated pathway, and to elucidate their contribution to antifungal resistance and C.g.<br />pathogenicity.