Integration of light and pheromone stimuli into vegetative and reproductive output pathways in Hypocrea jecorina

Abstract

Hypocrea jecorina (Anamorph Trichoderma reesei) ist ein filamentöser Ascomycet. Sein hohes Potential zur Sekretion cellulolytischer Enzyme führte zur weit verbreiteten Verwendung des Pilzes in verschiedenen industriellen Anwendungen. Um eine kontinuierliche Optimierung des Organismus für biotechnologische Applikationen zu gewährleisten, ist die Kenntnis grundlegender biologischer Charakteristika, aber auch spezifischer Signaltransduktionskomponenten unerlässlich. In dieser Arbeit sollten neue Erkenntnisse erbracht werden, die dazu beitragen längerfristiger Ziele, wie die Erhöhung der Cellulaseexpression von H. jecorina sowie die Entwicklung neuer Stammentwickulungsmethoden zu ermöglichen. Die Cellulaseexpression in H. jecorina erfolgt in Anwesenheit eines Inducers und wird durch den Belichtungsstatus moduliert. Die Expression dieser Gene reagiert also auf externe Stimuli. Die Weiterleitung dieser externen Reize wird durch Signalkaskaden bewerkstelligt, welche an eine transkriptionelle Antwort gekoppelt sind. Zwei kürzlich erschienene Studien beleuchteten die Rolle des Belichtungsstatus auf die Expression des Cellulasegenes cel7a (cbhI). Hierbei zeigte sich, dass die Anwesenheit des Lichtregulators ENV1 für eine normale Expression von cel7a und gna3 notwendig ist. Für die G-protein [alpha]-Untereinheit GNA3 wiederum konnte ein lichtabhängiger Effekt auf die Cellulaseexpression gezeigt werden. Um mehr über die Rolle der G-Proteine in der Übertragung externer Signale zu erfahren, wurde eine zweite G[alpha] -Untereinheit, GNA1, für weitere Analysen ausgewählt.<br />Die in dieser Arbeit angewandten Methoden beinhalteten die Analyse einer gna1 Deletionsmutanten, einer konstituiv aktivierten GNA1 Mutanten (Q204L), die Verwendung verschiedener Kohlenstoffquellen sowie stirkt kontrollierte Lichtverhältnisse, um die Funktion von GNA1 für Ausgangssignale wie Cellulaseexpression, Hydrophobinexpression, Biomasseproduktion und Stresstoleranz bewerten zu können. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass GNA1 entsprechende Signalwege entweder direkt oder indirekt, über den G[beta][gamma]-Komplex, beeinflusst. In diesem Zuammenhang konnte Licht als ein externer Reiz definiert werden welcher die Auswirkung des von GNA1 übertragenen Signals reguliert. Im Kontext biotechnologischer Relevanz wurde offenkundig, dass GNA1 externe Signale mit intrazellulären Signalwegen verbindet und hierbei Ausgangssignale wie Cellulaeexpression oder Hydrophobinexpression moduliert.<br />Auf Grund der bisher angenommenen sexuellen Sterilität des vermeintlichen H. jecorina Anamorphs T. reesei wurde dieser im biotechnologischen "Upstream Engineering" bisher Methoden wie gezielter oder zufälliger Mutagenese unterzogen. Die kürzlich beobachtete sexuelle Entwicklung des Pilzes eröffnet daher interessante neue Perspektiven für eine beschleunigte Stammverbesserung. Klassische Genetik könnte zum Beispiel eingesetzt werden, um Stammmerkmale zu kombinieren oder um Doppelmutanten herszustellen. Ein Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag daher auf der Erforschung von Signalübertragungsmechanismen, die im Zusammenhang mit sexueller Entwicklung stehen. So wurde im speziellen die Funktion des Pheromonsystems analysiert. Durch das Pheromonsystem werden extrazelluläre Signale generiert (Pheromone), welche die Erkennung eines Kreuzungspartners mittels kompatibler Pheromonrezeptoren erlauben. Hierbei ergab die Charakterisierung des Pheromonsytems von H.<br />jecorina, dass der Pilz über zwei Gene, ppg1 und hpp1, verfügt, welche Pheromonvorläuferproteine kodieren. PPG1 weist Charakteristca eines [alpha]-Faktor ähnlichen Lipopetidpheromonvorläuferproteins auf, während HPP1 als der erster charakterisierter Vertreter einer neuen Klasse von pilzlichen (Hybrid-) Pheromonvorläufer vorgeschlagen werden konnte, welche unter Hypocrea und Fusarium Spezies Verbreitung findet. Obwohl Transkripte bei der Pheromonvorläufergene in beiden H. jecorina Kreuzungstypen vorgefunden wurden, ließ sich eine klare Rolle von hpp1 für die männliche Fertilität im H. jecorina (T. reesei) MAT1-2 Kreuzungstyp nachweisen. Die Deletion von ppg1 hatte keinerlei Effekt auf die männliche Fertilität dieses Stamms, so dass sich eine analoge Funktion im MAT1-1 Kreuzungstyp vermuten ließe. Weiterhin wurde sowohl ein Einfluss von Licht als auch ein Einfluss vom Lichtregulator ENV1 auf die Expression von hpp1 gezeigt. Diese Befunde deuten auf eine Verknüpfung der Licht- und Pheromonsignaltransduktionswege in H.<br />jecorina hin. Bedingt durch die atypischen Struktur- und Expressionsmerkmale von hpp1 wurden im Folgeschritt kompatible Pheromonrezeptoren untersucht. Unter Anwendung des weiblich sterilen (T.<br />reesei) QM6a Stammes als Kontrolle, war es möglich eine kreuzungstypspezifische Funktion beider Pheromonrezeptoren (HPR1 und HPR2) zu demonstrieren. Durch die Einführung klassisch genetischer Methoden in das System H. jecorina konnte eine Reihe von Doppeldeletionsmutanten erstellt werden. Die funktionelle Analyse dieser Mutanten offenbarte eine überraschend geringe Kreuzungstypspezifität in Kreuzungspartnererkennung und Stromata-/Perithecienentwicklung. Diese interessante Besonderheit von H. jecorina erlaubte uns weiterhin die Rolle der Pheromonrezeptoren in der Ascosporenentwicklung zu untersuchen. Erstmals konnte so in einer heterothallischen Spezies eine strikt kreuzungstypspezifische Funktion des Pheromonsystems in diesem Entwicklungsschritt beobachtet werden. Auf Basis der Ergebnisse multibler Kreuzungsversuche an Mutantenstämmen sowie der Expressionsmuster der Pheromonvorläufer- und Pheromonrezeptorgene kann das a-Faktor Rezeptor ähnliche HPR1 als kompatibler Rezeptor für das Hybrid-Pheromon (HPP1) vorgeschlagen werden. Durch den regulatorischen Einfluss der PAS Domäne von ENV1 auf die hpp1-Expression wurde eine weiterführende Analyse der Rolle von Lichtsignaltransduktion auf Pheromonantwort und sexuelle Entwicklung durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die Gene blr1, blr2 und env1 in H.<br />jecorina deletiert. Die Deletion jedes dieser Gene hatte einen Einfluss auf die sexuelle Entwicklung von H. jecorina. Im Falle der White-Collar Homologe BLR1 und BLR2 führte deren Abwesenheit jedoch nicht zu männlicher oder weiblicher Sterilität. Im Gegensatz hierzu weist das Ausbleiben sexueller Entwicklungsstrukturen in einer Kreuzung zwischen einer H. jecorina ∆env1 Mutanten und dem weiblich sterilen T.<br />reesei QM6a unter Tageslichtbedingungen auf eine essentielle Funktion von ENV1 für weibliche Fertilität hin. In Übereinstimmung hiermit fand keine sexuelle Reproduktion zwischen H. jecorina ∆env1 Mutanten statt. Eine Expressionsanalyse von Pheromonvorläufer- und Pheromonrezeptorgenen beider Kreuzungstypen machte einen schwerwiegenden kreuzungstypspezifischen Effekt der env1 Deletion im Besonderen auf die Pheromonvorläufergene deutlich. Der kreuzungstypabhängige Effekt von env1 veranlasste uns weiter zu testen ob die Expression der Kreuzungstypgene in den Lichtregulatormutanten verändert sein könnte. So konnte am Beispiel von mat1-2-1 gezeigt werden, dass ein Kreuzungstypgen ein regulatorisches Ziel von Blaulichtregulatoren darstellt. Durch diese Befunde wird eine Vernetzung von Licht- und Pheromonsignaltransduktion offensichtlich. In diesem Zusammenhang könnte ENV1 eine zentrale Rolle durch seinen Einfluss auf G-Protein- und cAMP vermittelte Signaltransduktion einnehmen. Die White-Collar Homologe wiederum scheinen zumindest teilweise dadurch für optimale Reproduktionseffizienz zu sorgen, dass adäquate Mengen der Pheromonsystembestandteile zur Verfügung gestellt werden.<br />Indem Reaktionen auf externe Stimuli im Kontext biotechnologisch bedeutsamer Ausganssignale aufgeklärt wurden, beleuchten die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse wichtige Aspekte der Biologie von H.<br />jecorina/T. reesei. Diese bestehen in erster Linie in sexueller Entwicklung als Mittel zur Stammoptimierung aber auch in Aspekten der Cellulaseinduktion. Diese Erkenntnisse könnten in der Biotechnologie Anwendung finden und werfen darüber hinaus neue Fragen auf, welche dazu beitragen könnten H. jecorina als Modellorganismus für Photobiologie und sexuelle Entwicklung zu etablieren.

Hypocrea jecorina (anamorph Trichoderma reesei) is a filamentous ascomycete. Its high cellulolytic potential led to a widespread use of this fungus in various industrial applications. Both, the investigation of specific signaling components as well as the understanding of general processes of the fungus biology are important steps towards the goal of continuous optimisation its use in biotechnological applications. The enhancement of cellulase expression levels or the generation of methods facilitating strain improvement represent two goals towards which this thesis aimed to provide new insights. The expression of cellulases in T. reesei is inducer dependent and modulated by the light status. Hence, the expression of these genes responds to external stimuli. The transduction of the later involves signal transduction pathways through which the external signals are linked to a transcriptional response. Two recent studies highlighted the role of the light status in the regulation of the cellulase encoding gene cel7a (cbh1). The expression of both, gna3 and cel7a was shown to depend on a functional light regulator ENV1. In order to gain more knowledge about the role of G-proteins in the transmission of external signals we chose to analyse a second G[alpha]-subunit GNA1. The toolbox used in this study consisted of a gna1 deletion mutant, a constitutively activated GNA1 mutant (Q204L), the use of different carbon sources and strictly controlled light conditions to evaluate the role of GNA1 in output pathways as cellulase and hydophobin expression, biomass formation or stress tolerance. Hereby, gna1 was demonstrated to impact respective pathways either directly or indirectly through the G[beta][gamma] complex. Light was shown to be an environmental cue in this process modulating the relevance of the signal transmitted by GNA1.<br />In a biotechnological context, GNA1 was shown to link extracellular and intracellular signals modulating output pathways as cellulase or hydrophobin expression.<br />Due to its assumed sexual sterility the supposed H. jecorina anamorph T.<br />reesei was subject to random and targeted mutagenesis in biotechnological upstream engineering so far. The recently observed sexual development of the fungus provides intriguing perspectives for accelerated strain improvement. Classical genetics could for instance be applied to combine strain characteristics or to generate double knockout mutants. A major subject of this thesis thus consisted in the characterisation of signaling events related to sexual development in H.<br />jecorina. In particular the role of the pheromone system was analysed.<br />Through the pheromone system extracellular signals (pheromones) are generated allowing mate recognition through a pheromone receptor expressed by a compatible mating partner. Characterization of the H.<br />jecorina pheromone system revealed the presence of two pheromone precursor genes ppg1 and hpp1. PPG1 shows characteristics of [alpha]-factor-like lipopeptide pheromone precursor, HPP1 was proposed as the first characterized member of a new class of fungal (hybrid) pheromones distributed among Hypocrea and Fusarium species. Despite transcripts of both pheromone precursors were found in both H. jecorina mating type backgrounds a clear male fertility mediating role of hpp1 could be demonstrated in H. jecorina (T. reesei) MAT1-2. Deletion of ppg1 did not alter male fertility in this strain suggesting a mating type specific role of hpp1 for MAT1-1. Additionally, light and the light regulator ENV1 were shown to alter the expression of hpp1 hinting at an interconnection of light and pheromone response pathways in H. jecorina.<br />The unusual characteristics of pheromone precursor structure and expression patterns prompted us to investigate the cognate pheromone receptors in H. jecorina. Using the female sterile QM6a strain as a control, a mating type specific function for both pheromone receptors HPR1 and HPR2 became evident. By introducing classical genetics into the Hypocrea system, a set of double knockout mutants was generated. The functional analysis of these mutants revealed an unexpectedly low mating type specific role of the H. jecorina pheromone system in mate recognition and stromata/perithecia formation. This interesting particularity of H. jecorina further allowed us to examine the role of pheromone receptors in ascosporogenesis. For the first time in a heterothallic filamentous species we were hereby able to demonstrate a strict mating type specific function of the pheromone system in this developmental step. Using findings from multiple mutant crosses and expression patterns from pheromone precursor and receptor genes we moreover propose the hybrid-type pheromone as being recognized by the a-factor receptor HPR1 in H. jecorina. Due to the regulatory impact of the ENV1 PAS domain on hpp1 expression we further investigated the role of light signaling on pheromone response and sexual development in H. jecorina. To this end we deleted the blue light regulator genes blr1, blr2 and env1 in H. jecorina. The deletion of each of these genes affects sexual development in H.<br />jecorina. The absence of the White Collar homologues BLR1 and BLR2 however did not result in male or female sterility. ENV1 in turn was shown to be required for female fertility as indicated by a failure of stromata formation in a cross between a H. jecorina ∆env1 mutant and female sterile T. reesei QM6a in daylight. Consistently, crosses between H. jecorina ∆env1 mutants did not result in sexual reproduction under these conditions. Analysis of expression patterns of pheromone precursor and receptor genes in both H. jecorina mating type backgrounds revealed a serious mating type specific effect of env1 deletion especially on pheromone precursor genes. The mating type dependent impact of env1 prompted us to test whether the expression of mating type genes would be altered in the light regulator mutants. On the example of mat1-2-1 we were able to demonstrate a mating type gene to be a regulatory target of blue light regulators. Through these findings an interconnection of light and pheromone response pathways becomes evident. In this process ENV1 is likely to exert a crucial role through its impact on G-protein and cAMP mediated signaling. The White Collar homologues appear to optimise mating efficiency at least partly by appropriating the required levels of pheromone system constituents. Results provided by this thesis highlight crucial aspects in the biology of H. jecorina / T. reesei by elucidating responses to external stimuli in biotechnologically important output pathways. These consist especially in mating as a means of strain improvement but also in aspects of cellulase induction. These results are could find applications in biotechnology but also raise new questions establishing H. jecorina as model organism for fungal photobiology and sexual development.<br />