Das Mykotoxin Zearalenon (ZON) wird von mehreren Fusarium-Arten gebildet und kann häufig in Mais, Gerste, Hafer und Weizen gefunden werden. ZON wirkt im Säugetier östrogen-ähnlich und führt besonders bei Schweinen in der Viehwirtschaft zu Unfruchtbarkeit, Abort und verschiedenen anderen hyperöstrogenen Symptomen. Da eine Kontamination von Tierfutter mit ZON fast unvermeidbar ist, ist es von Interesse, ZON detoxifizieren zu können. Möglichkeiten der Detoxifizierung besteht im mikrobiellen oder enzymatischen in situ Abbau. Abbauprodukte sollten daher nicht oder zumindest weniger toxisch sein als die Ausgangssubstanz. Mit Hilfe der basidiomycotischen Hefe Trichosporon mycotoxinivorans (MTV) kann ZON abgebaut werden, wobei als Hauptmetabolit ZOM-1 entsteht. Dieser Metabolit wurde kürzlich isoliert und charakterisiert. Toxikologische Untersuchungen zeigten, dass er keine östrogene Wirkung mehr besitzt. Die Struktur des Metaboliten ist charakterisiert durch die Öffnung des makrocyclischen Rings von ZON an der Keto-Gruppe.
In unserem Labor wurden regelmäßig ZON-Abbauversuche mit MTV durchgeführt. Um die Versuche zu überwachen, wurde eine LC-UV-MS/MS Methode (MS/MS im MRM-Modus, Multiple Reactio Monitoring) mit kurzer Laufzeit benötigt, welche die Analyte ZON, a- und b-ZOL, die von Hefen üblicherweise gebildeten Metaboliten, sowie ZOM-1 umfassen sollte.
Zusätzlich wurden LacMet335 und LacMet291 inkludiert, zwei Metabolite, die durch enzymatischen Abbau von ZON mit Lactonohydrolase gebildet werden.
Diese Arbeit beschreibt die präparative Gewinnung von ZOM-1 und die Entwicklung und Validierung der LC-UV-MS/MS Methode. Die präparative Gewinnung von ZOM-1 wurde in Hinblick auf die Optimierung des entsprechenden Produktionsprozesses ausgeführt. Es wurden mikrobielle ZON-Abbauversuche mit MTV in mehreren Experimenten mit unterschiedlichen ZON-Konzentrationen durchgeführt.
Dabei wurde eine Ausbeute von etwa 60% ZOM-1 erreicht. Zur Vorreinigung und Anreicherung des so gewonnenen Metaboliten ZOM-1 wurde Festphasenextraktion (SPE) eingesetzt. Die Gewinnung erfolgte schließlich mittels präparativer HPLC. Eine ZOM-1-Reinheit von 95% wurde bestimmt. Die Lagerstabilität in unterschiedlichen Lösungsmitteln bei verschiedenen Temperaturen wurde untersucht. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass Lösungen von ZOM-1 in Acetonitril/Methanol/Wasser (45/10/45, v/v/v) nicht stabil sind, da die Langzeitstabilität für sieben Tage bei 60°C nicht gegeben war.
Durch Optimierung unterschiedliche Parameter (Säule, mobile Phase, Ionisationsquelle und MRMspezifische Parameter) wurde die LC-UV-MS/MS Methode erfolgreich erstellt. Schließlich wurde die Methode für Aerob-Puffer als flüssiges Kultivierungsmedium des mikrobiellen Abbaus validiert.
Methodenkenngrößen wie Nachweisgrenzen (25-50 ng/mL für UV, 7-41 ng/mL für MS), Bestimmungsgrenzen (57-150 ng/mL für UV, 21-123 ng/mL für MS), Wiederholpräzisionen (6.2-6.8% für UV, 10.2-14.3% für MS) und Wiederfindungen (91-99% für UV, 78-96% für MS) wurden für die Analyten ZON, ZOls und ZOM-1 bei einer UV-Wellenlänge von 274 nm ermittelt.
Eine andere Möglichkeit der in situ Detoxifizierung von ZON basiert auf seiner Adsorption im Gastrointestinaltrakt, wodurch die Bio-Verfügbarkeit und Aktivität des Toxins verringert werden.
Inaktiviertes MTV-Zellmaterial kann durch seine Fähigkeit zur Adsorption zur ZON-Detoxifizierung beitragen.
Da in vitro Techniken bei der Suche nach potentiellen Adsorbentien hilfreich sind, wurden auch verschiedene in vitro Tests wie Adsorptionsveruche mit ZON und wasserlöslichen Vitaminen, Adsorptions-/Desorptions-Experimente mit ZON und die Bestimmung von Adsorptionsisothermen durchgeführt. In diesem Zusammenhang wurde MTV-Zellmaterial und andere Bindermaterialien organischen und mineralischen Ursprungs wurden dabei untersucht. Ein Bentonit-Produkt zeigte eher niedrige Effektivität und erreichte ZON-Adsorptionsraten von 10- 45%, während die polymerbehandelten Bentonite stark erhöhte Adsorptionswerte von 80-100% zeigten. Hefe-Produkte adsorbierten 20-50% ZON, in Abhängigkeit vom pH-Wert. Vitaminadsorption wurde erfolgreich für Nicht-Hefe-Produkte getestet, wobei sehr niedrige Werte für Vitamin B5 und Vitamin B7/H gefunden wurden (3-10%). Im Gegensatz dazu wurden für Vitamin B12 stark unterschieldiche Werte gefunden. Das Organoclay-Produkt wie auch eines der polymerbehandelten Bentonite zeigten sehr niedrige Vitamin B12-Adsorption (< 5%), während das Bentonit-Produkt wie auch die beiden anderen polymerbehandelten Bentonite 30-80% des vorliegenden ZON adsorbierten.
Chemisorption-Indices der untersuchten Hefe-Bindermaterialien und des Bentonits lagen bei etwa 0.5-0.6, während die polymerbehandelten Bentonit-Produkte und der Organoclay-Binder Werte um 1.0 zeigten. Die Bestimmung der maximalen Adsorptionskapazität qmax und der Affinitätskonstante Kd war auf Grund der des annähernd linearen Verlaufs der Adsorptionsisotherme nicht möglich.
Zearalenone (ZON) is a mycotoxin produced by several Fusarium species. It is therefore often found as a contaminant especially in maize and barley, but also in oats and wheat. Since its occurrence is sometimes unavoidable in feed and ZON is known to be potentially estrogenic and able to cause infertility, abortion and other hyper-estrogenic symptoms especially in swine, it is of particular interest to detoxify ZON. One possible way of ZON-detoxification is its in situ degradation by microbes or enzymes. Products of microbial mycotoxin degradation should be non-toxic or at least less toxic than the original substance. By using the basidiomycete yeast Trichosporon mycotoxinivorans (MTV) to perform the degradation of ZON, ZOM-1 is produced as the main metabolite. ZOM-1 was recently isolated and characterized and found to be non-estrogenic. The structure of this novel metabolite is characterized by an opening of the macro-cyclic ring of ZON at its keto-group. In our laboratory, ZON degradation experiments using MTV needed to be monitored routinely using a short run-time LC-UV-MS/MS method (MS/MS performed in MRM mode, multiple reaction monitoring).
The method should cover ZON, a- and b-ZOL, which are usual yeast metabolites of ZON, as well as ZOM-1. Additionally, LacMet335 and LacMet291, two further metabolites formed after enzymatic degradation of ZON by lactonohydrolase, were included.
This work describes the preparative isolation of ZOM-1 and the development and validation of the LC-UV-MS/MS method. Preparative isolation of ZOM-1 was conducted with focus on the optimization of the production process, resulting in a yield of approximately 60% ZOM-1.
Therefore, large scale microbial biotransformation of ZON using MTV was carried out in several experiments with varying ZON concentration. The produced ZOM-1 was isolated using solid phase extraction (SPE) for its pre-purification and enrichment as well as preparative HPLC for its final isolation. ZOM-1 purity was tested to be approximately 95%. Storage stability was evaluated in solutions under different temperatures using various solvents. A solution of ZOM-1 in acetonitrile/methanol/water (45/10/45, v/v/v) was therby found to be unstable, as long term stability could not be verified for 7 days at 60°C. The LC-UV-MS/MS method was successfully developed by optimization of different parameters (column, mobile phase, ionization source and MRM specific parameters) and was finally validated in aerobic buffer as liquid cultivation medium as the appropriate matrix for microbial growth. Method characteristics as limits of detection (25-50 ng/mL for UV, 7-41 ng/mL for MS), limits of quantitation (57-150 ng/mL for UV, 21-123 ng/mL for MS) as well as repeatability (6.2-6.8% for UV, 10.2-14.3% for MS) and recovery (91-99% for UV, 78-96% for MS) were determined for ZON, ZOLs and ZOM-1 at a UV detection wavelength of 274 nm. Another possibility for the in situ detoxification of ZON is based on its adsorption in the gastrointestinal tract, thereby reducing its bioavailability/activity. Inactive MTV-cell material is considered to be able to detoxify ZON by adsorption. As in vitro techniques can be helpful in screening potential adsorbents, we performed various in vitro tests such as adsorption tests for ZON and water-soluble vitamins, ZON adsorption/desorption experiments and experiments for the determination of adsorption isotherms. In this context, MTV-cell material as well as other binding materials of organic and mineral origin were investigated.
A bentonite material was found to adsorb ZON rather ineffective at rates of 10-45%, while when treated with polymers adsorption rate was greatly increased up to 80-100%. Yeast-based products showed adsorption values in a range of 20-50%, depending on the pH-value of the applied medium.
Vitamin adsorption was carried out successfully for non-yeast products resulting in low adsorption values for pantothenic acid and biotin (3-10%) and highly different adsorption values for cobalamine. The organoclay sample as well as one of the polymer-treated bentonite samples showed very low cobalamine adsorption (< 5%), while the bentonite sample as well the two other polymer-treated bentonites showed 30-80% adsorption rate. Chemisorption indices of the tested bentonite and the yeast-based binding materials were approximately 0.5-0.6, whereas the polymer-treated bentonite and the organoclay came up to values of 1.0.
Determination of the maximal adsorption capacities qmax and the affinity constants Kd was not possible due to the almost linear curve progression of the isotherms.