Einbringung eines N-Acetylneuraminsäure Stoffwechselweges in Trichoderma atroviride

Abstract

N-Acetylneuraminsäure (NeuNAc, Neu5Ac oder NANA) ist der bekannteste Vertreter der Sialinsäuren (mehrfach hydroxylierte [alpha]-Ketosäuren), die hauptsächlich an den Enden von Oligosaccharidketten von Glykoproteinen oder -lipiden an der Außenseite der Zellmembran gefunden werden. Durch ihre Position spielen Sialinsäuren eine wichtige Rolle bei zellulären Erkennungs- und Adhäsionsprozessen. So auch im Infektionszyklus einiger Viren, die an NeuNAc an den Wirtszellen andocken. Zur Verbreitung im Wirtsorganismus müssen sich Viruspartikel von den befallenen Zellen lösen, was mit Hilfe einer Neuraminidase geschieht. NeuNAc-Derivate können als Neuraminidasehemmer fungieren und werden daher bereits erfolgreich in der Virustherapie eingesetzt.<br />Grundsätzlich wird NeuNAc durch Extraktion aus Milch oder Ei, Hydrolyse von Kolominsäure oder chemische Synthese gewonnen. Mittlerweile existieren auch einige Ansätze von biotechnologischen Herstellungsverfahren, die eine zweistufige Reaktion von N-Acetylglucosamin (GlcNAc) über N-Acetylmannosamin (ManNAc) zu NeuNAc gemein haben. Bei den meisten bekannten Prozessen ist zumindest ein Schritt enzymkatalysiert.<br />Chitin, das [beta]-1,4-glykosidisch verknüpfte Homopolymer von GlcNAc, ist nach Cellulose das am zweithäufigsten vorkommende Biopolymer und Produzenten chitinolytischer Enzyme sind unter Pro- und Eukaryoten zu finden. Filamentöse Pilze der Gattung Trichoderma sind für die Produktion dieser Enzyme bekannt und werden auch in der Industrie zur Chitinaseerzeugung eingesetzt.<br />Ein bereits erfolgreich in Trichoderma reesei eingebrachter NeuNAc-Syntheseweg wurde nun in Trichoderma atroviride transferiert. Der erste Schritt der enzymkatalysierten Kaskadenreaktion ist die Epimerisierung von GlcNAc zu ManNAc durch die GlcNAc-2-Epimerase (aus Anabaena sp. CH1). Die NeuNAc-Synthase (aus Campylobacter jejuni) setzt ManNAc zum Endprodukt NeuNAc um.<br />Die an der Kaskadenreaktion beteiligten Enzyme wurden heterolog in Escherichia coli als GST-Fusionsproteine exprimiert und charakterisiert.<br />In vitro Enzymassays dienten zur Bestimmung der optimalen Reaktionstemperatur und enzymkinetischer Parameter.<br />Kombinationsenzymassays gaben Aufschluss über das optimale Reaktionsverhältnis der Enzyme zueinander.<br />Mit den für die Enzyme kodierenden Genen und verschiedenen Promotoren wurden Transformationsplasmide konstruiert. Protoplastentransformation von T. atroviride P1 mit unterschiedlichen Kombinationen dieser Plasmide lieferte verschiedene Varianten von rekombinanten Stämmen. Die Insertion der für die Enzyme kodierenden Gene ins Pilzgenom und deren Transkriptionsraten wurden mit PCR bzw. qPCR überprüft. In vitro Enzymassays mit zellfreien Extrakten der rekombinanten Stämme wurden durchgeführt, um die Funktionalität der insertierten Enzyme zu prüfen.<br />Auch die Möglichkeit zur in vivo NeuNAc-Produktion durch direkte Anzucht der rekombinanten T. atroviride Stämme auf Chitin wurde getestet.<br />

N-Acetylneuraminic acid (NeuNAc, Neu5Ac or NANA) is the most prevalent exponent of the sialic acids (poly hydroxylated [alpha]-keto acids), which are commonly found as terminal residues of oligosaccharide chains of glycoproteins or glycolipids on the outermost cell surface.<br />Due to their location sialic acids play a major role in cellular recognition and adhesion processes as well as in the infection cycles of viral diseases, where viral particles attach to the NeuNAc on the host cells. For the propagation in the host a neuraminidase activity is needed to split the attached viral particles from the infected cells.<br />NeuNAc derivatives can act as neuraminidase inhibitors and are therefore successfully applied in therapy of virus-related diseases.<br />Traditionally NeuNAc is prepared through extraction from milk or egg, hydrolysis of colominic acid or chemical synthesis. At present some approaches to biotechnological production processes exist, which have the two-step reaction from N-Acetylglucosamine (GlcNAc) via N-Acetylmannosamine (ManNAc) to NeuNAc in common. In most of the procedures at least one of these steps is enzyme-catalysed.<br />Chitin, the homopolymer of [beta]-1,4-linked GlcNAc, is next to cellulose the second most abundant biopolymer and producers of chitinolytic enzymes are found in pro- and eukaryotes. Filamentous fungi of the genus Trichoderma are well known for the expression of these enzymes and are applied in industrial chitinase production.<br />A NeuNAc synthesis pathway, which was successfully engineered in Trichoderma reesei, was now introduced into Trichoderma atroviride. The first step of the enzyme catalysed cascade reaction is the epimerisation of GlcNAc to ManNAc by the GlcNAc-2-epimerase (from Anabaena sp. CH1).<br />The NeuNAc-synthase (from Campylobacter jejuni) converts ManNAc to the final product NeuNAc.<br />The enzymes participating in the cascade reaction were obtained as GST fusion proteins through heterologous expression in Escherichia coli and then characterised. In vitro enzyme assays were used to determine optimal reaction temperature and enzyme kinetic parameters. Combination enzyme assays gave information about the optimal reaction ratio of the two enzymes.<br />The genes coding for the enzymes and different promoter sequences were used to construct transformation plasmids. Protoplast transformation of T. atroviride P1 with different combinations of these plasmids provided several types of recombinant strains. Insertion of the genes, coding for the enzymes, into the fungal genome and their transcript level was determined by PCR and qPCR, respectively. In vitro enzyme assays with cell free extracts from the recombinant strains were performed to verify the functionality of the inserted enzymes. The feasibility of NeuNAc production in vivo was tested through direct cultivation of the recombinant T. atroviride strains on chitin.