In silico simulation of high throughput sequencing towards its application for studies of in situ diversity of fungi

Abstract

Die Trichoderma Spezies sind die am weitesten verbreiteten mitosporen Pilze (Teleomorphe Hypocrea, Hypocreales, Ascomycota, Dykaria). Sie wurden aus unzähligen natürlichen und künstlichen Substraten isoliert, was ihr hohes opportunistisches Potential und ihre Anpassungsfähigkeit an die verschiedensten ökologischen Bedingungen beweist. Die intensive Nutzung ihrer Eigenschaften machte diese Gattung industriell wichtig und somit auch gut erforscht. Außerdem wurden vor kurzem, auch drei komplette Genome öffentlich zugänglich gemacht. Die Vielfältigkeit dieser Gattung kann man auch als gut erforscht ansehen, wenn man davon absieht, dass diese völlig auf Proben, die aus in vitro Kulturen isoliert wurden, beruht. Keine Daten über die Vielfalt von Hypocrea/Trichoderma in natürlicher Umgebung (in situ) sind bis heute verfügbar. Das Ziel dieser Arbeit war es, die in silico Grundlage für die Anwendbarkeit von Hochdurchsatz-Sequenzierungsverfahren auf die in situ Vielfalt von Hypocrea/Trichoderma und verwandten Pilzen zu legen.<br />Die größte Herausforderung lag darin, die Eignung von rpb2 phylogenetischen Marker, entsprechend dem Teil des Gens, das die RNA Polymerase Untereinheit B II kodiert, zu bestimmen. Da Pyrosequenzierung einer Längenbeschränkung von 220-250 Basenpaaren unterliegt, muss das Zielgebiet kurz und aussagekräftig sein. Hierfür durchsuchten wir öffentliche Datenbanken, nach relevanten Hypocrea/Trichoderma rpb2 Sequenzen und entwarfen 27 potentielle Primerpaare, welche Fragmente der gewünschten Länge vervielfältigen. Dann verwendeten wir phylogenetische Rückschlüsse um die Fragmente gemäß ihrer Aussagekraft zu reihen. Die besten Primerpaare wurden dann in vitro, in Hinsicht auf deren Anwendbarkeit auf DNA Extrakte, von reinen Kulturen und auf Umweltproben hin verifiziert. Im letzen Schritt entwickelten wir ein in silico Hilfsprogramm, womit Sequenzen virtuell mutiert werden können, um festzustellen, wo der Grenzbereich der Sequenzpolymorphie liegt, in dem man noch aussagekräftige Werte über den ausgewählten Zielbereich erzielen kann. Das 220 Basenpaar lange Fragment in dem 5' Bereich des phylogenetischen Standardmarkers für Pilze wird für die Verwendung von Pyrosequenzierung auf Umweltproben empfohlen. Die Primer trpb2-1.5 und grpb2-7frev wurden entwickelt um Hypocrea/Trichoderma und nah verwandte Pilze zu vervielfältigen. Die Aussagekraft eines Fragmentes bleibt bis hin zu einer Sequenzpolymorphie von 10% erhalten.<br />

Trichoderma species are the most common mitosporic fungi (teleomorph Hypocrea, Hypocreales, Ascomycota, Dykaria). They have been isolated from an innumerable diversity of natural and artificial substrata what demonstrates their high opportunistic potential and adaptability to various ecological conditions. The intensive exploitation of the later properties made the genus industrially important and consequently well studied including the three complete genome sequences recently released for public access. The diversity of the genus might be also considered as well known except the fact that it fully relies on specimens isolated in pure culture in vitro. No data on the diversity of uncluttered Hypocrea/Trichoderma in natural environment (in situ) is available so far. The goal of the Thesis was to develop an in silico platform for the application of modern high throughput sequencing methods such as pyrosequencing to in situ diversity of Hypocrea/Trichoderma and related fungi. The main challenge of the work was to test the applicability of rpb2 phylogenetic marker corresponding to the part of the gene encoding the RNA polymerase subunit B II for this purpose. As pyrosequencing is length restricted to 200-250 nt the target locus should be both short but diagnostic. Therefore we first screened the public databases for relevant Hypocrea/Trichoderma rpb2 sequences and designed the set of 27 potential primer pairs which amplify fragments of requested length. Then we used phylogenetic inferences in order to rank the fragments based on their diagnostic power. The best loci/primer pairs were then in vitro verified for their applicability for PCR with DNA extracts from pure cultures and environmental samples. At the last step we developed an in silico tool to simulate virtually mutated sequences in order to set up a threshold of sequence polymorphism which will correspond to the reasonable diagnostic value of the selected target loci. The 220 bp fragment located in the 5' area of the standard fungal rpb2 phylogenetic marker is recommended for application of pyrosequencing to metagenomic environmental samples. The primers trpb2-1.5 and grpb2-7frev are designed to amplify Hypocrea/Trichoderma and closely related fungi. The diagnostic value of the fragment will be maintained for sequences with potential polymorphism level up to 10%.<br />