Development of a two-step bioprocess for CO2 fixation from industrial flue gas and production of a fuel chemical

Abstract

In Österreich kann der Großteil der ausgestoßenen Treibhausgase wie z.B. CO2 auf den Energie- und Industriesektor zurückgeführt werden. Die Vision einer CO2-neutralen Zukunft wird daher nur möglich sein, wenn die signifikante Reduktion der CO2 Emissionen in Kombination mit dem Übergang zu grüneren Energiequellen umgesetzt wird. CO2 als Substrat für mikrobielle Prozesse zu verwenden ist daher eine Möglichkeit, globale Kohlenstoffkreise zu schließen und eine Kreislaufwirtschaft zu etablieren.Das Ziel dieser Arbeit war, die Realisierbarkeit eines zweistufigen Prozesses zur CO2 Fixierung und Produktion einer Treibstoffchemikalie zu zeigen. Im ersten Schritt wird CO2 in einem industriellen Abgasstrom fixiert und mit dem acetogenen Mikroorganismus Acetobacterium woodii in Acetat umgewandelt. Dieses Zwischenprodukt wird dann in eine zweite Stufe überführt, wo ein rekombinanter Escherichia coli Stamm die Treibstoffchemikalien 2,3-Butandiol bzw. Isobutanol produziert. In Bezug auf die Massenbilanz des Gesamtprozesses sollte daher eine netto CO2 Fixierung über beide Stufen erreicht werden, während eine Treibstoffchemikalie aus CO2 über Acetat produziert werden sollte. Die Herausforderung für die Entwicklung eines solchen Prozesses liegt in mehreren Faktoren: (i) Komponenten des Industrieabgases, welche die CO2 Fixierung und Wachstum behindern können, (ii) die Toxizität von Acetat, (iii) die niedrige Energiedichte von Acetat und (iv) dass 2,3-Butandiol und Isobutanol nicht natürlich in E. coli produziert werden. Um diese Einflussfaktoren zu evaluieren, wurde in dieser Arbeit jeder Prozessschritt einzeln betrachtet und untersucht.Industrielles Gichtgas enthält signifikante Mengen an CO und CO2, es fehlt jedoch H2, der als Energiequelle für die CO2 Fixierung in A. woodii dient. Die CO2 Fixierung im Industrieabgas wird zusätzlich dadurch erschwert, dass CO toxisch ist und das Wachstum von A. woodii inhibiert. Es wurde daher die Strategie gewählt, das Gichtgas mit H2 als Energiequelle zu mischen und einen Prozess zu etablieren, wo CO im Flüssigmedium limitiert ist. Unter CO limitierten Bedingungen zeigten Daten aus dem Fließgleichgewicht eine gleichzeitige Verwertung von CO, CO2 und H2 und eine Acetat Produktivität von 14 mmol l-1 h-1. Das Mischen von Gichtgas und H2 ermöglichte nicht nur CO2 Fixierung im Industrieabgas, sondern es zeigte sich, dass das Mischungsverhältnis von Gichtgas zu H2 die Gasaufnahme, metabolische Flüsse und die Acetatproduktion beeinflusste und daher eine mögliche Kontrollstrategie für Gasfermentationen darstellt.Die Assimilation von Acetat in der zweiten Prozessstufe wird durch dessen Toxizität als schwache Säure behindert, was die Wichtigkeit der Wahl eines geeigneten Wirtes hervorhebt. Die Hypothese war, dass der robuste und stress tolerante E. coli W ein vielversprechender Kandidat für die Acetatverwertung und Umwandlung in eine Chemikalie wäre. Neben der Toxizität hat Acetat im Vergleich zu Zuckern auch eine geringere Energiedichte. Daher wurde die Acetatassimilation sowohl in Batch als auch in kontinuierlichen Kulturen untersucht. Acetat lag dabei entweder als einzige Kohlenstoffquelle oder zusammen mit Glucose vor, um die Energieverfügbarkeit zu erhöhen. Die Überexpression von Acetyl-CoA Synthetase, eines zweier Enzyme für die Acetatassimilation, verbesserte die Acetataufnahme sowie die gleichzeitige Verwertung mit Glucose im Batch. DieviiiEignung von E. coli W als effizienter Wirt für die Acetatverwertung wurde durch hohe Aufnahmeraten im Batch und kontinuierlichen Prozess bewiesen.Isobutanol wird von E. coli nicht natürlich produziert und rekombinante Produktion wurde in dieser Arbeit durch systematische Stammentwicklung, im Konkreten durch Untersuchung verschiedener Expressionsvektoren sowie Auswahl eines geeigneten Wirts, E. coli W, erreicht. Durch Einbeziehung der chemischen Eigenschaften von Isobutanol wurde ein Produktionsprozess entwickelt, der die effiziente Verwertung von sowohl Glucose im definierten Medium als auch dem Abfallstoff Molke ermöglichte, wobei hier eine finale Isobutanol Konzentration von 20 g l-1 erreicht werden konnte. Niedrige Produktausbeuten in Kombination mit der Flüchtigkeit von Isobutanol verhinderten jedoch eine weitere Entwicklung der Isobutanolproduktion aus Acetat. Es wurde daher die 2,3-Butandiolproduktion als Plattform herangezogen, um Wissen zur Produktion einer Chemikalie aus Acetat zu generieren. Es wurde ein chemisch definiertes Medium entwickelt, dass es erlaubte einen Prozess zu etablieren, wo Acetat als einzige Kohlenstoffquelle zur Produktion von 1.16 g l-1 Diolen (Acetoin und 2,3-Butandiol) führte.Diese Arbeit zeigte daher die Realisierbarkeit der netto CO2 Fixierung zur Produktion einer Treibstoffchemikalie in einem neuen zweistufigen Prozess. Die zeitaufgelöste Charakterisierung von physiologischen Parametern zusammen mit rationalem Prozess- und Screeningdesign erlaubten es Wissen über Acetatproduktion aus einem Industrieabgas sowie Acetatassimilation für mikrobielle Produktion zu generieren. Während Stammauswahl und -engineering ein wesentlicher Erfolgsfaktor für die Aufwertung von Acetat sowie die Umwandlung in eine Treibstoffchemikalie waren, diente die Quantifizierung im physiologischen Gleichgewicht, sowie dynamische Veränderungen dazu, limitierende Faktoren zu bestimmen. Aufgrund seiner flexiblen Eigenschaften kann die Plattformtechnologie, die in dieser Arbeit etabliert wurde, einen wichtigen Grundstein für die weitere industrielle CO2 Fixierung legen. Das Mischen zweier unabhängiger Gasströme kann als allgemeine Strategie zur Einstellung von Gas Zusammensetzungen für die CO2 Fixierung dienen und damit die Reduktion von industriellen CO2 Emissionen ermöglichen. In gleicher Weise haben die präsentierten Strategien für die Aufwertung der alternativen Rohstoffquelle Acetat Potenzial für die Etablierung einer Kreislaufwirtschaft am Weg zu einer CO2 neutralen Zukunft.

In Austria, the main part of greenhouse gases such as CO2 is produced by the industrial sector. The vision of a CO2 neutral future will only be fulfilled if a significant reduction of CO2 emissions goes hand in hand with a transition towards greener energy sources. Using CO2 as a substrate is one possibility to close carbon cycles and to establish a circular economy.This thesis aimed to show the feasibility of a two-step process for CO2 fixation and production of a fuel chemical. In the first process step, CO2 from an industrial source is fixed by the acetogenic microorganism Acetobacterium woodii and acetate is produced. The intermediate product acetate is then utilized by a genetically modified Escherichia coli, which produces the fuel chemicals isobutanol or 2,3-butanediol in the second process step. Considering the overall mass balance, the goal therefore was to achieve net CO2 fixation for both steps while producing a fuel chemical from CO2 via acetate. The development of such a process is challenged by several factors such as (i) components of the industrial flue gas inhibiting CO2 fixation and growth, (ii) acetate toxicity, (iii) the low energy density of acetate and (iv) 2,3-butanediol and isobutanol production not being native to E. coli. To investigate the influence of these factors, each step of the process was investigated individually in this thesis.Industrial blast furnace gas contains significant amounts of CO and CO2, but lacks H2, usually required for CO2 fixation in A. woodii. CO2 fixation in blast furnace gas is additionally complicated by the fact that CO is toxic and inhibits growth of A. woodii. The strategy therefore was to blend the industrial gas stream with H2 as an energy source and to design a process where CO is limited in the liquid medium. Using CO-limited conditions, steady state data during continuous cultivations showed co-utilization of CO, CO2 and H2 and acetate production at a rate of 14 mmol acetate l-1 h-1. Blending blast furnace gas with H2 not only enabled CO2 fixation in the industrial gas stream, but the ratio of flue gas stream to H2 was also shown to influence gas uptake, metabolic fluxes and product formation, thus providing a potential control strategy for gas fermentations.The assimilation of acetate in the second step is hindered by its toxicity as a weak acid, emphasizing the importance to select a suitable host. The robust and stress tolerant E. coli W was hypothesized to be a promising candidate for acetate utilization and upgrading into chemicals. Apart from being toxic, acetate also has a lower energy density compared to sugars. Therefore, acetate assimilation of E. coli W was investigated in batch and continuous cultures both as sole carbon source and during co-utilization with glucose to increase energy availability. Overexpression of acetyl-CoA synthetase, one of two pathways for acetate assimilation improved acetate uptake and co-utilization with glucose in batchviexperiments. The suitability of E. coli W as efficient host for acetate utilization was confirmed by high uptake rates during batch and continuous cultivations.Isobutanol is not naturally synthesized by E. coli, and recombinant production in this thesis was achieved by a systematic strain development approach relying on examination of different expression vectors and selection of a suitable host, E. coli W. Considering the chemical properties of isobutanol, a production process was developed, which allowed for the efficient utilization of both glucose on defined medium and the waste stream cheese whey, achieving a final isobutanol titer of 20 g l-1. Low product yields on acetate in combination with isobutanol volatility hampered the development of isobutanol production from acetate. Therefore, 2,3-butanediol served as a platform to establish knowledge on chemical production from acetate. A chemically defined medium was designed, enabling the development of a production process where feeding of acetate as sole carbon source led to the formation of 1.16 g l-1 diols (2,3-butanediol and acetoin).This thesis showed the feasibility of net CO2 fixation and production of a fuel chemical in a novel two-step process. Combining time-resolved characterization of physiological parameters with rational process and screening design allowed to generate knowledge on both acetate production from an industrial gas stream and upgrading of acetate for microbial chemical production. While strain selection and engineering were key to improving acetate assimilation and conversion into a (fuel) chemical, steady state quantification and dynamic shift experiments enabled the determination of parameters limiting the microbial cell factory. Due to its flexible nature, the platform technology developed in this thesis could be an important cornerstone in industrial CO2 fixation. Using blending of two independent gas streams as a general method for adjusting gas compositions to achieve net CO2 fixation might enable reduction of industrial CO2 emissions. Similarly, the strategies for upgrading the alternative feedstock acetate presented in this thesis carry potential for the establishment of a circular economy on the way towards a CO2 neutral future.