Development of a comprehensive testing strategy to detect DNA-reactive effects of food contact materials

Abstract

Within the current work a comprehensive FCM testing strategy based on a miniaturised version of the Ames test (Ames MPFTM) combined with suitable pre-concentration strategies was developed and validated. To select appropriate pre-concentration techniques the physico-chemical properties of about 700 suspected or proven Ames positive chemicals were evaluated using in-silico analysis. While the hydrophobicity of these substances was equally distributed over all hydrophobicity classes, an evaluation of volatility showed a skewed distribution towards involatile compounds: almost two thirds of chemicals were placed in the group of non-volatiles, while less than 10 % scored highly volatile and the remaining compounds were grouped into the intermediate classes. Based on this evaluation a set of model substances was selected to develop suitable pre-concentration techniques. An evaporationbased approach using a parallel evaporator was developed for the volatile simulant 95 % (v/v) ethanol. A mean concentration factor of 166 for non- and semi-volatiles was established, while a highly volatile model compound was lost. For more aqueous simulants, including water, 3 % (v/v) acetic acid and 10-50 % (v/v) ethanol, sequential solid phase extraction was selected as the most suitable method. Even though hydrophobic model substances tended to show higher substance recoveries than hydrophilic ones, a relatively high pre-concentration factor of 1,343 was determined overall.Further work focused on the optimisation and validation of the Ames MPFTM testing procedure. To monitor constant positive and negative control performance over time, quality control charts were established and were finally used to derive criteria for valid test runs. Further, the assay proved to have high accuracy, as five Ames positive and negative reference samples (plastics or coatings) were correctly classified. Similarly, high intra-laboratory reproducibility could be established, as 14 out of 16 Ames positive reference migrates showed a repeated positive outcome, when tested at least six times, and fulfilled the predefined criterion on the relative standard deviation (<50 %). Repeated testing of migration blanks and non-mutagenic reference migrates further confirmed a 100 % specificity. To evaluate - III -inter-laboratory reproducibility a multi-centre study with six operators from three different labs was performed. While Ames negative outcomes were reproducibly detected, five out of six operators recovered mutagenic effects correctly, most likely due to problems during sample preparation. An evaluation of the bioassay’s robustness against different FCM matrices uncovered that the test is indeed susceptible to inhibition, especially in the condition TA98 -S9 and at lower levels also in TA100 -S9. These effects proved to be manageable though, as a spiking procedure was established as an integral part of the testing scheme.For this purpose, Ames positive control substances were added to each migrate to evaluate whether or not a certain minimal level of revertants was reached in the presence of matrix components.At last, the established method was applied to test 141 real-life samples, including (mechanically) recycled and/or virgin plastics, papers, coatings and composite materials. While virgin FCMs scored mostly Ames negative, with slightly enhanced in-vitro mutagenicity levels only among coatings and papers, recycling was identified as a potential risk factor for DNA-reactivity. Especially some of the recycled polyolefin materials induced rather high signals, which proved to be reproducible over several batches from different production years. This analysis therefore showed that further research is urgently needed in the field of recycling to allow the application of these materials in direct food contact in the future. Further, the results confirmed that the Ames MPFTM test is a valuable tool to uncover safety hazards and should be part of a comprehensive risk assessment strategy.

Im Rahmen der aktuellen Studien wurde eine umfassende LMK Teststrategie rund um eine miniaturisierte Version des Ames Tests (Ames MPFTM) in Kombination mit geeigneten Aufkonzentrierungsverfahren entwickelt und validiert. Um passende Aufkonzentrierungsverfahren auszuwählen, wurden zunächst die physikalisch-chemischen Eigenschaften von etwa 700 vermeintlich oder bestätigt Ames positiven Chemikalien mittels in-silico Analyse untersucht. Während die Hydrophobizität der Stoffe gleichmäßig über alle Hydrophobizitätsklassen verteilt war, zeigte eine Bewertung der Flüchtigkeit eine Häufung an nicht flüchtigen Verbindungen: Fast zwei Drittel der Substanzen wurden der Gruppe der nicht flüchtigen Stoffe zugeordnet, während weniger als 10 % als sehr flüchtig eingestuft wurden und die übrigen Verbindungen dazwischen lagen. Basierend darauf wurden verschiedenste Modellsubstanzen ausgewählt, die zur Entwicklung geeigneter Aufkonzentrierungsverfahrenverwendet wurden. Für das flüchtige Simulanzlösemittel 95 % (v/v) Ethanol wurde eine auf Verdampfung basierende Methode unter Verwendung eines Parallelverdampfers entwickelt. Ein durchschnittlicher Aufkonzentrierungsfaktor von 166 für nicht- und mittelflüchtige Stoffe wurde ermittelt, während eine hochflüchtige Modelsubstanze nicht wiedergefunden werden konnte. Für wässrigere Simulanzien, einschließlich Wasser, 3 % (v/v) Essigsäure und 10-50 % (v/v) Ethanol, wurde eine sequentielle Festphasenextraktion als die geeignetste Methode ausgewählt. Obwohl hydrophobe Modellsubstanzen tendenziell höhere Substanzausbeuten aufwiesen als hydrophile Verbindungen, ergab sich insgesamt ein relativ hoher Aufkonzentrierungsfaktor von 1,343.Die weiteren Arbeiten konzentrierten sich auf die Optimierung und Validierung des Ames MPFTM Testverfahrens. Um zu überprüfen, ob die eingesetzten Positiv- und Negativkontrollen konstante Ergebnisse liefern, wurden Qualitätsregelkarten erstellt, die schließlich zur Ableitung von Akzeptanzkriterien verwendet wurden. Außerdem zeigte der Test eine hohe - V -Richtigkeit, da fünf Ames positive bzw. negative Referenzproben (Kunststoffe oder Beschichtungen) korrekt klassifiziert wurden. Ebenso konnte eine hohe laborinterne Reproduzierbarkeit bestätigt werden, da 14 von 16 Ames positiven Referenzmigraten bei mindestens sechsfacher Analyse wiederholt ein positives Ergebnis zeigten und weniger als 50 % relative Standardabweichung aufwiesen. Die wiederholte Analyse von Migrationsblindwerten und nicht mutagenen Referenzmigraten ergab zudem eine Spezifität von 100 %. Zur Bewertung der laborübergreifenden Reproduzierbarkeit wurde eine Ringversuchsstudie mit sechs Operator*innen aus drei verschiedenen Laboren durchgeführt. Während Ames negative Proben von allen Teilnehmenden reproduzierbar identifiziert wurden, konnten nurfünf der sechs Anwender*innen mutagene Effekte korrekt identifizieren, was höchstwahrscheinlich auf Probleme bei der Probenvorbereitung zurückzuführen ist. Bei Robustheitstests mit verschiedenen LMK Matrizes wurde gezeigt, dass tatsächlich vermehrt Inhibierungen auftreten, insbesondere bei der Testbedingung TA98 -S9 und in geringerem Ausmaß auch bei TA100 -S9. Diese Problematik war allerdings handhabbar, indem ein Spiking Verfahren als wesentlicher Bestandteil des Testschemas eingeführt wurde. Jedes Migrat wurde dafür mit Ames positiven Kontrollsubstanzen dotiert, um zu bewerten, ob in Gegenwart von LMK Matrixkomponenten eine bestimmte Mindestanzahl an Revertanten gebildet wird.Schließlich wurde die etablierte Methode zur Prüfung von 141 Realproben angewendet, darunter (mechanisch) rezyklierte und/oder neue Kunststoffe, Papiere, Beschichtungen und Verbundwerkstoffe. Während die nicht rezyklierten LMKs größtenteils Ames negativ waren, mit leicht erhöhten Anteilen an in-vitro mutagenen Materialien in der Gruppe der Beschichtungen und Papiere, wurde Recycling als potenzieller Risikofaktor für DNA-Reaktivität identifiziert. Insbesondere einige Materialien unter den rezyklieren Polyolefinen verursachten relativ hohe Signale, die über mehrere Chargen aus unterschiedlichen Produktionsjahrenreproduzierbar waren. Anhand der durchgeführten Analysen konnte daher gezeigt werden, dass auf dem Gebiet des Recyclings dringender Forschungsbedarf besteht, um zukünftigdie Verwendung von rezyklierten Materialien im direkten Lebensmittelkontakt zu ermöglichen. Darüber hinaus bestätigten die Ergebnisse, dass der Ames MPFTM Test ein nützliches Verfahren ist, um Sicherheitsrisiken aufzudecken und daher Teil einer umfassenden Risikobewertungsstrategie sein sollte.