Quality by Design meets extremophiles - development of a scalable continuous upstream process for Sulfolobus acidocaldarius

Abstract

The thermoacidophilic organism Sulfolobus acidocaldarius harbors the potential for many biopharmaceutical applications. Particularly liposomes containing archaeal lipids, archaeosomes, have sparked attention for their use in oral drug delivery. S. acidocaldarius’ membrane, like all archaeal membranes, contains ether-linked lipids instead of ester-linked lipids - a characteristic substantial for surviving at its optimal growth conditions of 75 °C and a pH value of 3.0 while maintaining a cytoplasmic pH of 6.5. Another key feature is the organism’s adaptability towards changes in the environmental conditions, termed homeoviscous adaption. This is done by modifying its membrane lipid composition, like incorporating cyclopentane rings, altering the tetraether to diether ratio, and changing the lipid’s headgroups. These correlations could be utilized for tailoring the lipid pattern and, thus, the formulated archaeosomes’ characteristics. However, in order for this biopharmaceutical application to ever reach industrial scale, the upstream processing needs to be thoroughly characterized, optimized, and scalable. This was done by applying a Quality by Design (QbD) approach, which focuses on ensuring the quality of the product already at the design and developmental stages and further throughout the production cycle. For process understanding, a physiological characterization of S. acidocaldarius in a controlled, continuously performed cultivation was performed. The optimal pH, dilution rate as well as the affinity constants, Ks, for the used substrates were identified. To omit quality-by-testing procedures used mostly in industry and aiding continuous manufacturing, an at-line flow cytometry-based process analytical tool (PAT) was developed. The viability of the cell population impacted by shifts in the process parameter pH was determined in an appropriate time manner (30 minutes) in contrast to the time-lagged results (6 days) obtained by the state-of-the-art method plating assay. Scale-up from 2 L to 200 L was achieved by applying the scale-independent parameter, constant oxygen mass transfer rate (kLa). A kLa of ~40 h-1 proved to be sufficient for adequate oxygen supply throughout all scales. This thesis describes one important step for the Archaeon S. acidocaldarius on its way into industrial application.

Der thermoacidophile Organismus Sulfolobus acidocaldarius birgt das Potenzial für viele biopharmazeutische Anwendungen. Besonders Liposomen, die Lipide von Archaeen enthalten, sogenannte Archaeosomen, haben Interesse für die Verwendung bei der oralen Arzneimittelabgabe entfacht. Die Membran von S. acidocaldarius enthält wie alle Archaeen Ether-verknüpfte Lipide anstelle von Ester-verknüpften Lipiden. Eine charakteristische Eigenschaft, um unter den optimalen Wachstumsbedingungen von 75 °C und einem pH-Wert von 3,0 überleben und gleichzeitig einen cytoplasmatischen pH-Wert von 6,5 aufrechterhalten zu können. Ein weiteres Merkmal ist die Anpassungsfähigkeit des Organismus an Veränderungen der Umweltbedingungen, die als „homeoviscous adaption“ bezeichnet wird. Dies geschieht durch Modifizierung der Lipidzusammensetzung in der Membran wie der Einbau von Cyclopentanringen, Änderung des Verhältnisses von Tetraether zu Dietherlipide und die Änderung der Kopfgruppen des Lipids. Diese Korrelationen könnte zum Anpassen des Lipidmusters und damit die Archaosomeigenschaften verwendet werden. Damit diese biopharmazeutische Anwendung jemals den industriellen Maßstab erreichen kann, muss der Upstream-Prozess gründlich charakterisiert, optimiert und skalierbar sein. Dies wurde durch die Anwendung eines Quality by Design (QbD) Ansatzes erreicht, der sich darauf konzentriert, die Qualität des Produkts bereits in der Design- und Entwicklungsphase und über den gesamten Lebenszyklus hinweg sicherzustellen. Zum Prozessverständnis wurde eine physiologische Charakterisierung von S. acidocaldarius in einer kontrollierten, kontinuierlichen Kultivierung durchgeführt. Der optimale pH-Wert, die optimale Verdünnungsrate sowie die Affinitätskonstanten, Ks, für die verwendeten Substrate wurden identifiziert. Um die meist in der Industrie verwendeten Quality-by-Testing-Verfahren wegzulassen und die kontinuierliche Kultivierung zu unterstützen, wurde ein at-line Durchflusszytometrie basierendes Prozessanalysetool (PAT) entwickelt. Die Viabilität, die durch Änderung des Prozessparameters pH beeinflussten Zellpopulation wurde in einem angemessenen Zeitraum (30 Minuten) bestimmt, im Gegensatz zu den zeitverzögerten Ergebnissen (6 Tage), die bisher durch Ausplattieren, dem Stand der Technik, ermittelt wurde. Der Upscale von 2 L auf 200 L wurde durch Anwendung des maßstabsunabhängigen Parameters, der konstanten Sauerstoff-Massentransferrate (kLa), erreicht. Ein kLa von ~40 h-1 erwies sich als ausreichend für eine adäquate Sauerstoffversorgung in allen Größen. Diese Doktorarbeit beschreibt einen wichtigen Schritt für das Archaeon S. acidocaldarius auf seinem Weg in die industrielle Anwendung.