Secondary metabolites of the biocontrol fungus Trichoderma atroviride : profiling and structural characterisation by LC-MS/MS and GC-MS

Abstract

Das Ziel dieser Dissertation war die chemische Analyse der vom Biokontrollpilz Trichoderma atroviride ATCC 74058 (P1) gebildeten Sekundärmetaboliten.<br />Ein Schwerpunkt der Arbeit war die Entwicklung von flüssigchromatographisch-(tandem)massenspektrometrischen Methoden [LC-MS(/MS)] zur Untersuchung von Peptaibiotika in Pilzkulturproben. Nach Entwicklung einer Analysenstrategie wurde nach Peptaibiotika gesucht, unter Berücksichtigung des für die Peptaibiotika-spezifische Aminosäure alpha-Aminoisobuttersäure (Aib) typischen MS/MS-Masseninkrements von delta m/z 85. Dabei wurden 20 Peptaibole aus der Gruppe der Trichorzianine nachgewiesen. Analytische Standardmischungen dienten zur Bestätigung dieser Ergebnisse und zur Erstellung einer auf "Selected Reaction Monitoring" (SRM) basierenden LC-MS/MS-Methode. LC-SRM gestattete den Nachweis von 16 Trichorzianinen pro Lauf und wurde für das Profiling dieser Peptaibole in Kulturfiltraten unterschiedlicher Pilzstämme benutzt. Weiters wurden auch 15 Peptaibiotika in Kulturproben des Wildtyps P1 nachgewiesen. Ein Vergleich mit 780 in der Literatur publizierten Sequenzen ergab keine Übereinstimmungen mit bereits bekannten Strukturen. Für die neuen kurzen Peptaibiotika wurde von uns der Gruppenname "Trichoatrokontine" vorgeschlagen.<br />Ein weiterer Teil der Dissertation behandelte die Etablierung und Anwendung einer Methode basierend auf Festphasen-Mikroextraktion (SPME) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) zur Bestimmung von flüchtigen organischen Stoffwechselprodukten (MVOCs) des Pilzes T. atroviride P1 im Dampfraum von Pilzkulturen (HS). Auf Basis definierter Kriterien (Spektrenvergleich mit Datenbanken, Retentionsindices) konnten in den GC-MS-Chromatogrammen 26 Substanzen (aus Substanzklassen, wie z.B. Alkohole, Monoterpene, Sesquiterpene, Pyrone) identifiziert werden. 14 dieser MVOCs wurden zuvor noch nicht für Trichoderma spp. beschrieben und 11 Verbindungen davon zusätzlich mit Hilfe von Reinstandards bestätigt. Pilzkulturen wurden nach unterschiedlichen Kultivierungszeiten untersucht, wobei sich charakteristische Änderungen in der Konzentration einzelner Substanzen und im Metaboliten-Expressionsmuster ergaben.<br />

The aim of this Ph.D. thesis was the chemical analysis of secondary metabolites produced by the biocontrol fungus Trichoderma atroviride ATCC 74058 (P1).<br />A focus of the work was the development of liquid chromatographic-(tandem) mass spectrometric [LC-MS(/MS)] methods for analysing peptaibiotics in fungal culture samples. A workflow was used for screening peptaibiotics, considering the MS/MS mass increment delta m/z 85 typical for the peptaibiotics-specific amino acid alpha-aminoisobutyric acid (Aib). This led to the detection of 20 long-chained peptaibols (trichorzianines). Analytical standard mixtures were used to confirm these findings and for creating an LC-MS/MS method based on selected reaction monitoring (SRM). LC-SRM allowed to determine 16 trichorzianines per run and was successfully used for profiling of these peptaibols in cultures of various fungal strains. Furthermore, 15 novel short peptaibiotics were detected in cultures of the wildtype strain P1, which were named "trichoatrokontins".<br />The second part of the thesis consisted in the establishment and application of a method for determination of microbial volatile organic compounds (MVOCs) in the headspace (HS) of T. atroviride P1 cultures using solid-phase microextraction (SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Using specific criteria, 26 fungal volatiles (from compound classes such as alcohols, monoterpenes, sesquiterpenes, pyrones) could be identified, 14 of which were never reported for Trichoderma spp. before. The identity of 11 of these metabolites was confirmed using pure standards. Fungal cultures were examined after different cultivation times, yielding characteristic changes in metabolite expression levels.