Faktoren des Xylanase-II-Transkriptosoms in Trichoderma reesei : Isolation und Charakterisierung

Abstract

Der Weichfäulepilz Trichoderma reesei, die anamorphe Form von Hypocrea jecorina, findet breite technische Anwendung aufgrund seiner Fähigkeit, eine Vielzahl von extrazellulären Hydrolasen (Cellulasen, Xylanasen, Glucanasen etc.), die zum Abbau von Biomasse benötigt werden, zu produzieren. Mit dem Ziel der qualitativen und quantitativen Verbesserung der Enzymproduktion wurden die relevanten regulatorischen Mechanismen auf molekularer Ebene bereits für eine Vielzahl von Hydrolase-kodierenden Gene in T. reesei untersucht. Studien über die Expression der beiden bedeutendsten Xylanasen (XYN I und XYN II) haben gezeigt, dass der trans-agierende Faktor Xyr1 für die positive Regulation mehrerer Gene innerhalb des cellulolytischen und xylanolytischen Enzymsystems (u. a. für xyn1 und xyn 2) verantwortlich ist. Die Xylanasen I und II werden jedoch nicht auf koordinierte Weise exprimiert. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, spezifische Aktivatoren bzw.<br />Repressoren im Xylanase-II-System zu identifizieren und ihre Mechanismen aufzuklären. Diese Regulatoren binden als trans-agierende Faktoren im Bereich des 55-bp-langen Promotor-Fragmentes mit den cis-agierenden Elementen (CCAAT-Box, Xylanase-aktivierendes Element [XAE2] und AGAA-Box).<br />Zum einen stellt Ace2, das an XAE2 bindet, solch einen Faktor dar.<br />Anhand von Fermentationen und Umtopfversuchen eines delta-ace2-Stammes und einer ace2-Retransformante wurde im Zuge dieser Diplomarbeit der zeitliche Verlauf des xyn2-Transkriptionsniveaus und der Xylanaseaktivitäten genau verfolgt. Wir verwendeten für all unsere Experimente diese beiden Stämme und kultivierten sie auf Xylan bzw. auf Medien mit dem Induktor Xylobiose. Dadurch konnte die Retransformante als solche verifiziert und der ace2-Deletionsstamm sowie die ace2-Retransformante charakterisiert werden. Durch Untersuchungen der Kernproteine und Überprüfung auf deren Phosphorylierung wurde versucht, Rückschlüsse auf die Art der Aktivierung von Ace2 zu erhalten.<br />Zum anderen wurde mittels Oligonukleotid-vermittelter DNA-Affinitätschromatographie versucht, den an die AGAA-Box bindenden Faktor, einen möglichen Repressor des Xylanase-II-Systems, zu identifizieren. Durch die massenspektroskopische Analyse aller mittels Affinitätschromatographie abgetrennten Proteine konnte der Kreis der eventuell beteiligten Proteine auf vier eingegrenzt werden.<br />

The soft rot fungus Trichoderma reesei (the anamorph of Hypocrea jecorina) is able to produce a variety of extracellular hydrolases (cellulases, xylanases, glucanases, etc.) that function as wood-degrading enzymes. It is therefore widely used in industrial environments. In order to improve both quantity and quality of enzyme production, the relevant regulatory mechanisms have been investigated at the molecular level in a number of hydrolase-coding genes in T. reesei.<br />As studies on the expression of the two major xylanases (XYN I und XYN II) have demonstrated, the regulation of several genes within the cellulolytic and xylanolytic enzyme system (xyn1 and xyn2, among others) is strictly dependent on the trans-acting factor Xyr1 (xylanase regulator 1). However, the xylanases I and II are not expressed in a coordinated fashion. This thesis attempts to identify specific activators and repressors in the Xylanase-II system and elucidate their mechanisms. As trans-acting factors, they bind to the cis-acting elements (CCAAT motif, xylanase-activating element [XAE2] and AGAA box) within the 55-bp promoter fragment of xyn2.<br />Ace2, which binds to XAE2, was one of the factors investigated in our study. We examined the temporal progress of the transcriptional level of xyn2 and the xylanase enzyme activities in fermentations and replacement experiments of a delta-ace2 strain and an ace2-retransformant. We used these two strains throughout our research, cultivating them both on xylan and on media containing xylobiose as inducer. As a result of our experiments, the retransformant was confirmed, and the ace2-deletion strain and ace2-retransformant were characterized. Moreover, we attempted to draw conclusions on the mechanisms of activation of Ace2 through analyses of nuclear proteins and their phosphorylation. In a second step, we sought to identify the AGAA binding protein-a possible repressor of the xylanase-II system-using oligonucleotide affinity chromatography. The MS analysis of all proteins separated by affinity chromatography enabled us to limit the number of potentially involved proteins to four.