Genome editing in Aureobasidium pullulans via Cas9 ribonucleoproteins and PEG-mediated protoplast transformation

Abstract

Aureobasidium pullulans ist ein polymorpher hefeähnlicher Ascomycet, der in verschiedensten Lebensräumen und unter verschiedensten Umweltbedingungen zu finden ist. Er wird vorwiegend als Biokontrollmittel in der Landwirtschaft und zur industriellen Herstellung des Biopolymers Pullulan verwendet. Zu den möglichen zukünftigen Anwendungsmöglichkeiten gehören die Produktion extremotoleranter Enzyme, antimikrobieller Verbindungen, Schweröle, Siderophore und anderer Biopolymere. Die Entwicklung einer effizienten Genom-Editierungs-Strategie für A. pullulans ist daher notwendig, um weitere Forschung und die Erzeugung leistungsfähiger Stämme für industrielle Anwendungen zu ermöglichen. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung eines Polyethylenglykol (PEG)-vermittelten Protoplastentransformationsprotokolls und einer CRISPR/Cas9-basierten Genom-Editierungs-Strategie unter Verwendung von Cas9-sgRNA Ribonukleoproteinen (RNPs) für A. pullulans. Um das Transformationsprotokoll zu testen, wurden die Stämme EXF-150 (Referenzstamm), NBB 7.2.1 und ATCC 42023 mit den Hygromycin-Resistenz vermittelnden Plasmiden pAN7-1 und pRLMEX30 transformiert. pAN7-1 und pRLMEX30 enthalten das bakterielle Hygromycin B-Phosphotransferase-Gen (hph), flankiert von Promotor- und Terminatorelementen von Aspergillus nidulans bzw. Trichoderma reesei. Für den Referenzstamm wurden Transformationsraten von bis zu 8,6 KBE pro μg Plasmid-DNA erreicht. Southern-Hybridisierung zeigte ektopische Integration des Plasmids pRLMEX30 und extrachromosomale Präsenz von pAN7-1. Das entwickelte Transformationsprotokoll wurde anschließend für die Einbringung von RNPs zur Genom-Editierung in A. pullulans verwendet. Das ura3-Gen (kodierend für Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylase) konnte in allen drei A. pullulans Stämmen, nur allein mit RNPs, zerstört werden. Die resultierende Uridin-Auxotrophie konnte mit ura3 Homologen aus Trichoderma reesei (pyr4) bzw. Aspergillus fumigatus (pyrG) kompensiert werden. Darüber hinaus wurden die nicht direkt selektierbaren Gene praics (kodierend für ein Gen des Purin-Biosynthesewegs) und asl (kodierend für ein Gen des L-Arginin-Biosynthesewegs) im Referenzstamm durch Co-Targeting des selektierbaren Markers ura3 in einem Multiplexing-Ansatz erfolgreich manipuliert. Die erhaltenen auxotrophen Stämme könnten für weitere Studien verwendet werden. Schließlich konnte die homologe Rekombinationsrate im Referenzstamm durch die Verwendung von RNPs, sogar in Kombination mit kurzen (20 bp) homologen Flanken, auf fast 100% gesteigert werden. Diese Arbeit zeigt, dass Cas9 RNPs mittels PEG in A. pullulans-Protoplasten eingebracht werden können und dort eine schnelle und effiziente Genom-Editierung ermöglichen.

Aureobasidium pullulans is a polymorphic yeast-like ascomycete that can be found in diverse habitats and environmental conditions. It is used as a biocontrol agent in agriculture and for the industrial production of the biopolymer pullulan. Potential future applications include the production of extremotolerant enzymes, antimicrobial compounds, heavy oils, siderophores and other biopolymers. Thus the development of an efficient genome editing strategy for A. pullulans is necessary to allow for further research and generation of powerful strains for application in industry. This work describes the development of a polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast transformation protocol and a CRISPR/Cas9-based genome editing strategy using Cas9-sgRNA ribonucleoproteins (RNPs) for A. pullulans. To test the transformation protocol, the strains EXF-150 (reference strain), NBB 7.2.1 and ATCC 42023 were transformed to hygromycin resistance, using plasmids pAN7-1 and pRLMEX30 that contain the bacterial hygromycin B phosphotransferase gene (hph) flanked by promoter and terminator elements of Aspergillus nidulans and Trichoderma reesei, respectively. For the reference strain transformation rates of up to 8.6 CFUs per μg plasmid DNA were achieved, and Southern hybridization of transformants revealed integration of plasmid pRLMEX30 and presence of pAN7-1 extrachromosomally. The developed PEG-mediated transformation protocol was used for the delivery of RNPs for genome editing in A. pullulans. Disruption of the ura3 gene (encoding for orotidine-5'-phosphate-decarboxylase) was successfully achieved in all three A. pullulans strains using only RNPs. The resulting uridine auxotrophy could be complemented with ura3 homologous from Trichoderma reesei (pyr4) and Aspergillus fumigatus (pyrG), respectively. Further, manipulation of not directly selectable genes praics (encoding a gene of the purine biosynthesis pathway) and asl (encoding a gene of the L-arginine biosynthesis pathway) in the reference strain was achieved by co-targeting the selectable marker ura3 in a multiplexing approach. The obtained auxotrophic strains could be used for further studies. Lastly, the homologous recombination rate in the reference strain could be increased to nearly 100% by the usage of RNPs, even in combination with short (20 bp) homologous flanks. This work shows that Cas9 RNPs can be delivered into A. pullulans protoplasts using PEG and allow for fast and efficient genome editing.