Two novel laboratory diagnostic methods for the direct and serological detection of Toxoplasma gondii: development, evaluation and application in a daily routine laboratory : Investigation of the cytoprotective role of Quercetin in an in vitro model of peritoneal dialysis

Abstract

Der erste und zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Entwicklung und Evaluation zweier neuer molekularbiologischen Verfahren zur Detektion von Toxoplasma gondii. Dieser protozoische Parasit hat etwas ein Drittel der Weltbevölkerung infiziert und eine Infektion während der Schwangerschaft kann zu einer Übertragung des Parasiten von der Mutter auf das Kind führen, welche oft asymptomatisch im Krankheitsverlauf ist. Konnatale Toxoplasmose ist mit einem breiten Spektrum an klinischen Zeichen und Symptomen wie Retinochorioiditis, intrazerebrale Verkalkung, Hydrozephalus und mentaler Retardierung assoziiert, welche erst bei Geburt oder im Laufe des Lebens des Säuglings auftreten können. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Entwicklung eines neuen quantitativen fast real-time PCR Assays für die sensitive und spezifische Direktdetektion des 200- bis 300-mal vorkommenden 529-bp repetitiven Elements im T. gondii Genom beschrieben.<br />Die entwickelte Methode ermöglicht die erfolgreiche Detektion selbst von geringsten T. gondii Erregerzahlen in Fruchtwasser. Aufgrund der Anwendung eines schnellen PCR-Zyklus Protokolls wurde die Gesamtanalysenzeit auf unter eine Stunde verkürzt und dennoch konnten akkurate Ergebnisse erzielt werden. Im zweiten Teil wurde ein erst kürzlich eingeführter Screening VITROS Test zur serologischen Detektion von Toxoplasmen Immunglobulin G und Immunglobulin M für die Diagnose von akuter und latenter T. gondii Infektion in Sera schwangerer Frauen evaluiert. Die Kombination der beiden Assays zeigte eine hohe Sensitivität und Spezifität von 100% bei der Erkennung einer akuten T.<br />gondii Infektion. Die Leistungsmerkmale der Assays wurden mit dem von der Weltgesundheitsbehörde empfohlenen Referenztest von Sabin-Feldman verglichen.<br />Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der zytoprotektiven Rolle des Bioflavanoids Quercetin in einem in vitro Modell der Peritoneal Dialyse (PD). Während einer PD weisen Mesothelzellen eine schwere Schädigung aufgrund der kontinuierlichen Exposition von Peritonealdialysaten und deren zytotoxischer physiochemischer Wirkung auf. In dieser Studie wurden immortalisierte humane Mesothelzellen entweder regulärem Wachstumsmedium, Standard Laktat gepuffertem oder einem besser biokompatibleren Laktat-Bikarbonat gepufferten Dialysat ausgesetzt. Die Zytotoxizität wurde qualitativ durch morphologische Beurteilung und quantitativ durch das Freisetzen von zytoplasmatischer Laktat-Dehydrogenase ermittelt. Eine neue "Fluorescence Activated Cell Sorting" (FACS) Methode zur Bestimmung der Viabilität von Mesothelzellen wurde angewandt. Abschließend wurde gezeigt, dass die Zugabe von Quercetin einen alternativen Ansatz zur Protektion der Mesothelzellen vor Zellzytoxizität oder häufig verwendeten Peritonealdialysaten darstellt.<br />

The first and the second part of this dissertation present the development and evaluation of two novel molecular biological methods for the detection of Toxoplasma gondii. This protozoan parasite infects up to a third of the world's population and infection is often asymptomatic during pregnancy and may lead to maternal-fetal transmission. Connatal Toxoplasmosis is associated with a wide spectrum of clinical signs and symptoms, such as retinochorioiditis, intracerebral calcification, hydrocephalus and mental retardation, which may be present at birth or develop later in life of the newborn. In the first part of the thesis a new quantitative fast real-time PCR assay was developed for the sensitive and specific direct detection of the 529-bp repeat element occurring up to 200 - 300 times in the T. gondii genome. The developed method provides the successful detection of even low copy numbers of T.<br />gondii in amniotic fluid. Due to the application of fast PCR cycling protocols the total analysis run-time was below one hour thus providing accurate test results. In the second part, a newly introduced VITROS Toxoplasma Immunoglobulin G and Immunoglobulin M assay was evaluated as a screening method for the serological diagnosis of acute T. gondii infection in the sera of pregnant women. The combination of both assays demonstrated a high sensitivity and specificity of 100% for the successful detection of acute T. gondii infection. The performance of these assays was compared with the Sabin-Feldman dye test which is proposed by the World Health Organization as a reference test for the detection of T. gondii infection.<br />The third part of the present thesis was concerned with the cytoprotective role of the bioflavonoid Quercetin in an in vitro model of peritoneal dialysis (PD). During PD, mesothelial cells have been shown to undergo severe damage due to continuous exposure to peritoneal dialysis fluid (PDF) with cytotoxic physicochemical properties. In this study immortalized human mesothelial cells were exposed either to regular growth medium, to standard acidic lactate-buffered or to a more biocompatible lactate-bicarbonate-buffered PDF. Cytotoxicity was assessed qualitatively by morphologic assessment and quantitatively by the release of cytoplasmic lactate dehydrogenase. A new application was introduced using fluorescence-activated cell sorting (FACS) for the assessment of the viability of mesothelial cells. In conclusion, the addition of Quercetin may represent an alternate approach to protect mesothelial cells from the cytotoxicity of frequently used PDFs.