Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zur Biosynthese der Dihydrochalkone am Modellsystem Apfel

Abstract

Dihydrochalkone sind biochemisch mit den Flavonoiden verwandt und werden zur Gruppe der "minor flavonoids" gezählt. Am bekanntesten sind die Phloretin-Derivate von Malus sp., die mehr als 90 % des löslichen Gesamtphenolgehalts in den Blättern ausmachen. Das Phloretin 2´-O-Glukosid (Phloridzin) wird häufig in Zusammenhang mit der Resistenz der Apfelpflanze gegen Phytopathogene diskutiert. Die Biosynthese der Dihydrochalkone war biochemisch und molekularbiologisch bislang nur wenig untersucht.<br />Malus x domestica wurde aufgrund der umfangreichen öffentlich zugänglichen Sequenzinformationen sowie der Bedeutung und des starken Vorkommens der Phloretin-Derivate als Modellpflanze zur Untersuchung der Biosynthese der Dihydrochalkone anhand von Phloridzin ausgewählt. Die dabei entscheidenden enzymatischen Schritte sind die Bildung von p-Dihydrocumaroyl-CoA aus p-Cumaroyl-CoA, die Synthese von Phloretin aus p-Dihydrocumaroyl-CoA und drei Molekülen Malonyl-CoA sowie die Glukosylierung von Phloretin zu Phloridzin.<br />Mit Proteinpräparationen wurde gezeigt, dass außer Malus x domestica auch Pflanzen, in denen Dihydrochalkone bislang nicht nachgewiesen wurden, in der Lage sind, p-Dihydrocumaroyl-CoA aus p-Cumaroyl-CoA zu synthetisieren. Dies weist auf eine Dehydrogenase hin, die nicht unbedingt ein spezifisches Enzym der Dihydrochalkon-Biosynthese sein muss. In der vorliegenden Arbeit konnte die Dehydrogenase nicht endgültig identifiziert werden. Es wurden allerdings einige mögliche Enzyme ausgeschlossen und weitere in Frage kommende cDNA-Klone isoliert.<br />Deren Beteiligung an der Biosynthese der Dihydrochalkone soll mit entsprechenden transgenen Pflanzen von Arabidopsis thaliana oder Malus x domestica geklärt werden.<br />Weiters wurden fünf cDNA-Klone der Chalkonsynthase aus dem Apfel isoliert und heterolog exprimiert. Mit den rekombinanten Enzymen konnte gezeigt werden, dass außer p-Cumaroyl-CoA auch p-Dihydrocumaroyl-CoA als Substrat akzeptiert wird. Chalkonsynthasen können demnach die Biosynthese von Phloretin katalysieren. Damit dürfte es keine spezielle Chalkonsynthase im Apfel geben, die spezifisch für die Bildung von Naringeninchalkon oder Phloretin verantwortlich ist.<br />Außerdem wurden drei cDNA-Klone von Glykosyltransferasen aus dem Apfel isoliert und heterolog exprimiert. Zwei der rekombinanten Enzyme glukosylieren Phloretin zum Phloretin 2´-O-Glukosid. Ein weiteres führt zur Bildung eines Glukosids, das vermutlich das Phloretin 4´-O-Glukosid ist. Die mögliche phytopathologische Relevanz der Dihydrochalkon 2´-O-Glykosyltransferase-Aktivität im Zusammenhang mit dem Feuerbrand wird diskutiert.<br />Zusätzlich wurden zu Vergleichszwecken homologe cDNA-Klone der Chalkonsynthase und zwei Glykosyltransferasen aus der Birne isoliert, welche nach heterologer Expression dieselbe enzymatische Aktivität wie die entsprechenden rekombinanten Enzyme des Apfels aufweisen. Die nah mit dem Apfel verwandte Birne kann demnach sehr wahrscheinlich nur aufgrund der fehlenden Dehydrogenaseaktivität keine Dihydrochalkone bilden.<br />

Dihydrochalcones are biochemically related to flavonoids and are classified as "minor flavonoids". The phloretin derivatives of Malus sp., which represent more than 90 % of the soluble phenolics in leaves, are the best known dihydrochalcones. The phloretin 2´-O-glucoside (phloridzin) is often discussed concerning the pathogen resistance of apple trees. The biosynthesis of dihydrochalcones has, to date, rarely been investigated at the biochemical and molecular biological level. In the present work Malus x domestica was used as a model plant for investigations on the biosynthesis of the dihydrochalcone phloridzin due to the extensive sequence information that is currently available and the importance and high content of phloretin derivatives in this plant species. The required enzymatic steps are (i) the formation of p-dihydrocoumaroyl-CoA from p-coumaroyl-CoA, (ii) the synthesis of phloretin from p-dihydrocoumaroyl-CoA and three molecules of malonyl-CoA, and (iii) the glucosylation of phloretin to phloridzin.<br />With protein preparations it was possible to show that Malus x domestica, as well as other plant species which do not naturally synthesize dihydrochalcones, are able to reduce p-coumaroyl-CoA to p-dihydrocoumaroyl-CoA. This indicates that the dehydrogenase seems to be not specific for the biosynthesis of dihydrochalcones. At present, the dehydrogenase could not be finally identified. However, some enzyme candidates were excluded and some further cDNA clones were isolated.<br />Their involvement in the biosynthesis of dihydrochalcones will be elucidated in the future through transgenic Arabidopsis thaliana or Malus x domestica plants.<br />Five cDNA clones of the chalcone synthase were isolated from apple and heterologously expressed. The recombinant enzymes accepted p-coumaroyl-CoA and p-dihydrocoumaroyl-CoA as substrates. Therefore, chalcone synthases from apple are able to catalyse the formation of phloretin. This also implies that there seems to be no specific chalcone synthase for the formation of naringenin chalcone or phloretin present in apple.<br />Moreover, three cDNA clones of glycosyltransferases were isolated and heterologously expressed. Two of the recombinant enzymes catalyse the glucosylation of phloretin to phloretin 2´-O-glucoside. The third glucosylates phloretin most likely to phloretin 4´-O-glucoside. The possible phytopathological relevance of the activity of the dihydrochalcone 2´-O-glycosyltransferase concerning fire blight resistance is discussed.<br />For comparison, homologous cDNA clones of the apple chalcone synthase and glycosyltransferases were isolated from the closely related genus Pyrus. The recombinant enzymes showed the same enzymatic activity as the homologues from apple. Therefore, the absence of dihydrochalcones in pear is most likely determined by the absence of the dehydrogenase activity.