Methods for the quantification of diagnostic microbial gene targets in the environment: development, evaluation and application

Abstract

In den letzen Jahren haben molekular-biologische Methoden neue Möglichkeiten zur Untersuchung von Mikroorganismen in ihren natürlichen aber auch künstlichen Lebensräumen eröffnet. Eine dieser Methoden ist die quantitative PCR (qPCR), die empfindlichste Methode zur Quantifizierung von Nukleinsäuren. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation werden neu entwickelte Methoden zur Detektion mehrerer interessanten genetischen Markern aus der Umwelt vorgestellt.<br />Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem speziesspezifischen Nachweis des bedeutenden pflanzenpathogenen Pilzes Fusarium graminearum direkt aus Pflanzenmaterial. F. graminearum ist der Erreger einer Reihe von Krankheiten von landwirtschaftlich bedeutenden Getreidesorten und verursacht alljährlich beträchtlichen wirtschaftlichen Schaden. Die entwickelte Methode beruhend auf dem Nachweis eines spezifischen ß-tubulin Gen Markers erlaubt die Identifizierung und Quantifizierung von F. graminearum sogar in frühen Stadien der Infektion.<br />Der zweite und dritte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Nachweis von genetischen Markern, die eine Identifikation von Verursachern fäkaler Verunreinigung erlauben. Die vorgestellten Methoden wurden für eine Anwendung in einem Karstquell-Einzugsgebiet entwickelt.<br />Die Zuordnung der fäkalen Kontamination in Quelwasser zu spezifischen Verursachergruppen wie z. B. Weidevieh oder menschlichem Eintrag, würde eine wesentliche Erleichterung für das Einzugsgebietsmanagement darstellen, was zu einer Verbesserung der Rohwasserqualität beiträgt.<br />Darüber hinaus bietet sie eine wesentliche Grundlage für eine Systemevaluierung und Risikoanalyse. Zu diesem Zweck wurden zwei Methoden zur Verursacheridentifikation basierend auf dem qPCR Nachweis von fäkalen 16S rRNA Gen Markern für Wiederkäuer bzw. den Menschen entwickelt. Beide Methoden zeigten ausgezeichnete Spezifität für ihre Zielgruppen und Nachweisgrenzen für frischen Fäzes im Nanogrammbereich pro untersuchetem Wasservolumen. Bei der Anwendung auf Wasserproben aus dem Untersuchungsgebiet zeigten die Markerkonzentration eine gute Übereinstimmung mit dem Ausmaß fäkaler Beeinflussung.<br />Zusammenfassend hat sich die Anwendung der qPCR auf umweltanalytische Fragestellungen als richtungsweisend für die direkte Quantifizierung von Mikroorganismen in der Umwelt erwiesen.<br />

In recent years molecular biological methods have opened new ways of investigating the occurrence of microorganisms in their native and artificial habitats. Among this group quantitative PCR (qPCR) is the most sensitive method for the quantification of nucleic acids. This dissertation presents the development and aplication of methods for the detection of several interesting environmental microbial gene targets.<br />The first part of this thesis deals with the species specific detection of the important plant pathogen Fusarium graminearum directly from infected plant material. F. graminearum causes diseases in various agriculturally important crops leading to severe economical damage. The developed method based on the detection of ß-tubulin gene marker specific for the species F. graminearum successfully combined the identification and quantification of the fungus even in early stages of infection.<br />The second and third parts of the present thesis are concerned with the detection of genetic markers specific for sources of faecal pollution in water. The methods were developed for application in an alpine karstic spring catchment area. Relating faecal pollution in spring water to specific sources like livestock, wildlife or human influence will facilitate the catchment management leading to improvements in source water quality. To this end two microbial source tracking (MST) methods for the detection and quantification of a ruminant-specific and a human-specific 16S rRNA genetic marker by qPCR were developed. Both methods exhibited a high source specificity and detection limits in the range of nanograms of fresh faecal material per investigated volume of water. When applied on environmental water samples the levels of marker concentrations were in good accordance with the expected levels of faecal influence.<br />In conclusion the development of qPCR methods on environmental diagnostic problems has proved to be a powerful approach and will offer new insights in the environmental sciences.