Towards the development of a novel biological feed additive for mycotoxin degradation : isolation, structural elucidation and quantification of biotransformation-products of the estrogenic zearalenone

Abstract

Mykotoxine sind giftige Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen und stellen eine erhebliche Gefahr für die Gesundheit von Mensch und Tier dar. Die Mykotoxin-Problematik beschäftigt alle Segmente der Nahrungsmittel- und Futterindustrie insbesondere weil Schätzungen nach bis zu 25% der weltweiten Getreideproduktion von der Kontamination mit Mykotoxinen betroffen ist. Effiziente Methoden zur Inaktivierung der Mykotoxine sind deshalb von großem Interesse. In diesem Zusammenhang ist die Zugabe von Adsorbentien zu Futtermitteln eine in der Praxis verbreitete Inaktivierungsmethode. Allerdings sind die eingesetzten Bindemittel nicht spezifisch und können daher zur Verminderung des ernährungsphysiologischen Wertes des Tierfutters führen. Ein spezifischer Ansatz um die nachteiligen Auswirkungen von Mykotoxinen zu verhindern ist ihre biologische Umwandlung zu nicht-toxischen Metaboliten mit Hilfe von Enzymen oder Mikroorganismen, die z. B. als Futtermittelzusatzstoffe Anwendung finden können.<br />Die in dieser Dissertation beschriebene Forschungsarbeit trägt zur Entwicklung eines biologischen Futtermittelzusatzes für die Inaktivierung des Mykotoxins Zearalenon (ZON) bei. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Isolierung und Strukturaufklärung von ZON-Abbauprodukten sowie die Etablierung effizienter Screening- als auch quantitativer- Analysemethoden zur Bestimmung von ZON und seiner Metabolite. ZON ist ein oestrogen wirksames Mykotoxin, das von verschiedenen Fusarium-Arten vor allem auf Mais produziert wird, weshalb es in einer Vielzahl an Lebens- und Futtermitteln nachgewiesen werden kann.<br />Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere hundert verschiedene Stämme von Mikroorganismen auf ihre Eignung zur Metabolisierung von ZON untersucht.<br />Zu diesem Zweck wurden Proben aus ZON-Abbauversuchen mittels Dünnschichtchromatographie und LC-DAD-MS/MS in MRM mode auf eine Abnahme der ZON-Konzentration im Kulturmedium getestet. Die ZON-Metabolisierung der interessantesten Mikroorganismen wurde im Detail untersucht.<br />Ein wesentlicher Teil der Arbeit bestand in der Untersuchung des mikrobiologischen Abbaus von ZON von der Hefe Trichosporon mycotoxinivorans DSM 14153 (MTV).<br />Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) in Kombination mit Dioden-Array-Detektion (DAD), Time-of-Flight Massenspektrometrie (TOF-MS) und Kernresonanzspektroskopie (NMR) wurden erfolgreich eingesetzt, um die chemische Struktur des gebildeten Hauptmetaboliten (ZOM-1) aufzuklären. Die neuartige Struktur des Metaboliten ZOM-1 wurde als 5-({2,4-dihydroxy-6-[(1E)-5-hydroxypent-1-en-1-yl] benzoyl) oxy)-hexansäure identifiziert. Bei einem Test mit einem sensiblen Hefe-Bioassay konnte gezeigt werden, dass ZOM-1 nicht mehr Östrogen wirkt. Darüber hinaus zeigte ZOM-1 keine Wechselwirkung mit dem menschlichen Östrogen-Rezeptor in einem in-vitro-kompetitiven Assay.<br />In Bezug auf den Mechanismus der mikrobiellen Metabolisierung von ZON zu ZOM-1 wurde in dieser Arbeit ein zweistufiger Mechanismus vorgeschlagen.<br />In einem ersten Schritt wird vermutlich durch eine Monooxygenase die Bildung einer zusätzlichen Laktonfunktion katalysiert. Durch die anschließende Hydrolyse der neu gebildeten Laktongruppe entsteht schließlich ZOM-1. Trotz umfangreicher Anstrengungen, waren wir weder in der Lage diese Hypothese zu widerlegen noch in der Lage experimentelle Beweise für die Bildung des vorgeschlagenen Baeyer-Villiger-Zwischenprodukts zu erhalten.<br />Weiters wurde die Metabolisierung von ZON durch eine rekombinante Laktonhydrolase untersucht. Durch Anwendung von LC-DAD-MS/MS und NMR-Techniken wurde die Bildung von (E)-2,4-dihydroxy-6-(10-hydroxy-6-oxo-1-undecenyl)-benzoesäure (LacMet1) als der Hauptmetabolit identifiziert. Decarboxylierung dieses Metaboliten wurde ebenfalls beobachtet und führte zu Bildung von (E)-1-(3,5-dihydroxyphenyl)-10-hydroxy-1-undecen-6-on (LacMet2). Diese beiden Metabolite wurden auch in Proben von Gliocladium roseum MA918 nach Inkubation mit ZON identifiziert. Im Gegensatz zu früheren Studien anderer Arbeitsgruppen konnte gezeigt werden, dass die Stabilität von LacMet1 für seinen Nachweis und die anschließende Isolierung aus dem Kulturmedium ausreichend ist.<br />Der dritte Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die Metabolisierung von ZOM-1 mittels einer rekombinanten Laktonhydrolase. LC-DAD-MS/MS Messungen führten zur Identifizierung der beiden neuen Metabolite (E)-2,4-dihydroxy-6-(5-hydroxy-1-penten-1-yl)-benzoesäure (ZOM- LH1) und (E)-5-(5-hydroxy-1-penten-1-yl)-1,3-benzendiol (ZOM-LH2), deren Bildung hier zum ersten Mal beschrieben wird.<br />Während dieser Arbeit wurden zahlreiche qualitative und (semi-) quantitative Analyseverfahren entwickelt und erfolgreich auf biologische Proben angewendet, um die chemische Natur von Abbauprodukten des Mykotoxins Zearalenon zu identifizieren und zu charakterisieren. Als eines der vielversprechendsten Ergebnisse unserer Arbeiten konnten wir die Struktur eines neuartigen ZON-Abbauprodukts aufklären und zeigen, dass dieser Metabolit keine oestrogene Aktivität mehr aufweist. Die in Zusammenarbeit mit Mikrobiologen und Molekularbiologen gewonnenen Erkenntnisse bilden eine gute Grundlage für die Fortsetzung der Entwicklung eines neuartigen Futtermittelzusatzes zur biologischen Inaktivierung von ZON.<br />

Mycotoxins are secondary metabolites produced by various species of fungi and may cause a variety of short-term as well as long-term adverse health effects in humans and animals. Mycotoxins are of great concern to all segments of the food and feed industries especially as up to 25% of the world's cereal grains may be contaminated with mycotoxins.<br />Therefore, efficient methods for the inactivation of mycotoxins (in the intestinal tract of animals) are of great interest for both farmers as well as the feed industry. In this context, adsorption of mycotoxins by binding agents is becoming common practice. However, the non-specific adsorption of binders can be problematic. A more specific approach to prevent the adverse effects of mycotoxins is their transformation to non-toxic metabolites, by means of enzymes or microbial strains which can be applied e.g. as feed additives.<br />The research described in this thesis contributes to the development of a biological feed additive for the inactivation of the mycotoxin zearalenone (ZON). The studies concentrated on the structure elucidation and isolation of ZON-degradation products and the establishment of efficient screening as well quantitative analytical methods for the determination of ZON and its related metabolites. ZON is a potent estrogenic mycotoxin produced by several Fusarium species most frequently on maize and affects therefore a variety of foods and animal feeds. Several hundreds of microorganisms were investigated for their potential to metabolize ZON. For this purpose, samples were monitored by thin layer chromatography and LC-DAD-MS/MS in MRM mode. The most interesting microorganisms were investigated in detail.<br />A substantial part of the thesis was dealing with biodegradation of ZON using the yeast Trichosporon mycotoxinivorans DSM 14153 (MTV). Liquid chromatography tandem spectroscopy (LC-MS/MS) in combination with diode array detection (DAD), time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS), and nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) were applied successfully to elucidate the chemical structure of the major metabolite. It was determined to be the novel structure 5-({2,4-dihydroxy-6-[(1E)-5-hydroxypent-1-en-1-yl]benzoyl}oxy)hexanoic acid, which we termed ZOM-1. When tested in a sensitive yeast bioassay ZOM-1 was found to be non-estrogenic. Furthermore, ZOM-1 did not interact with the human estrogen receptor in an in vitro competitive binding assay. Regarding the mechanism of the microbial metabolization of ZON to ZOM-1 we proposed a two step mechanism involving firstly a Baeyer-Villiger reaction to the formation of a newly formed lactone bond and secondly a lactone opening by a lactone/esterase to the formation of ZOM-1. Despite comprehensive efforts to dismiss this hypothesis or to obtain experimental evidence for the formation of the proposed Baeyer-Villiger intermediate of ZON, we were neither able to verify nor falsify the proposed degradation mechanism.<br />We also investigated the metabolization of ZON by a recombinant lactonohydrolase and, by application of LC-DAD-MS/MS and NMR techniques, identified the formation of (E)-2,4-dihydroxy-6-(10-hydroxy-6-oxo-1-undecenyl)benzoic acid (LacMet1) as the main metabolite. Decarboxylation of this metabolite was also observed and led to (E)-1-(3,5-dihydroxyphenyl)-10-hydroxy-1-undecene-6-one (LacMet2). These two metabolites were also identified in samples of Gliocladium roseum MA918 after incubation with ZON. In contrast to previous studies reported from other working groups LacMet1 was revealed to be stable enough for its detection and isolation from the culture medium.<br />The third part of the thesis, focused on the metabolization of ZOM-1 by a recombinant lactonohydrolase. LC-DAD-MS/MS measurements led to the identification of the two novel metabolites (E)-2,4-dihydroxy-6-(5-hydroxy-1-penten-1-yl)benzoic acid (ZOM-LH1) and (E)-5-(5-hydroxy-1-penten-1-yl)-1,3-benzenediol (ZOM-LH2), which are described here for the first time.<br />In conclusion, numerous qualitative and (semi)quantitative analytical methods were developed and successfully applied to biological samples in order to identify and characterize the chemical nature of biodegradation products of the mycotoxin zearalenone. One of the most promising findings consists of the identification and full structure characterization of a novel metabolite of ZON formed by T.<br />mycotoxinivorans, which we termed ZOM-1. This metabolite was shown to be non-estrogenic. The results generated in co-operation with microbiologists and molecular biologists form a good basis to further develop a novel additive for the biological inactivation of ZON in animal feed.