Einbringen eines N-Azetyl-Neuraminsäure Syntheseweges in Trichoderma reesei

Abstract

Trichoderma spp. sind Produzenten von extrazellulären Enzymen für den Abbau von Zellulose, Hemizellulosen und Chitin. Besondere Relevanz besitzt dabei Trichoderma reesei, dessen hydrolytische Enzyme in der Industrie breite Anwendung finden, vor allem in der Papier-, Textil-, Lebens- und Futtermittelindustrie, sowie bei der Produktion von Biotreibstoff. N-Azetyl-Neuraminsäure, die in den Glykokonjugaten der Zelloberfläche von Säugetieren vorkommt, spielt eine wichtige Rolle in der Zellerkennung und in Adhäsionsprozessen. Ihre Derivate wiederum werden als Neuraminidasehemmer bei der Therapie viraler Erkrankungen, wie zum Beispiel Influenza A und B, eingesetzt. Die industrielle Produktion der pharmazeutisch interessanten N-Azetyl-Neuraminsäure erfolgt derzeit über einen zweistufigen, enzymatisch katalysierten Prozess, der eine Zugabe von Pyruvat im Überschuss benötigt, dessen Abtrennung während der Aufarbeitung sehr kostspielig ist. Um die Produktion von N-Azetyl-Neuraminsäure zu optimieren, soll Trichoderma als Ganzzellkatalysesystem für die Synthese von N-Azetyl-Neuraminsäure eingesetzt werden, da Trichoderma selbst Phosphoenolpyruvat für die Enzymreaktion zur Verfügung stellt. Die Verwendung von Trichoderma als Ganzzellkatalyst hat den zusätzlichen Vorteil, dass der Stamm Trichoderma atroviride Chitin bis auf das Monomer N-Azetyl-Glukosamin abbauen kann. Dieses wiederum fungiert als Substrat für die Herstellung von N-Azetyl-Neuraminsäure nach Übertragung des entsprechenden Syntheseweges, der zuvor in Trichoderma reesei etabliert wurde. Im Zuge dieser Diplomarbeit wurden daher die Enzyme N-Azetyl-Glukosamin-2-Epimerase aus Anabaena sp. CH1 und N-Azetyl-Neuraminsäure-Synthase aus Campylobacter jejuni in Trichoderma reesei eingebracht, um einen zwei-enzymkatalysierten Stoffwechselweg für die Synthese von N-Azetyl-Neuraminsäure in vivo zu erhalten. Dazu wurden die für die Transformation benötigten Vektoren konstruiert und die erhaltenen Transformanten auf die Integration der Gene hin untersucht.<br />In rekombinanten Trichoderma reesei Stämmen wurde in der Folge die Bildung eines Transkriptes nachgewiesen und anschließend die Enzymaktivität in den zellfreien Extrakten bestimmt. Parallel dazu wurden die beiden Enzyme als GST-Fusionsproteine in E. coli exprimiert und mit deren Hilfe eine Charakterisierung durchgeführt, um die für die Enzyme geeignete Temperatur und Inkubationszeit zu ermitteln.<br />

Trichoderma spp. are producers of extracellular enzymes for the degradation of cellulose, hemicelluloses and chitin. Trichoderma reesei is of special importance, because its hydrolytic enzymes are used in a wide range of industrial applications, such as textile, paper, food and feed industries, as well as in the production of biofuels.<br />N-Acetyl neuraminic acid, which is found in the glycoconjugates of mammalian cell surfaces, plays an important role in cell recognition and adhesion processes. Its derivates are used as neuraminidase inhibitors for the therapy of viral infections, such as influenza A and B. The industrial production of the pharmaceutically interesting N-Acetyl neuraminic acid is achieved via a two-step enzyme catalyzed process, which is rather expensive due to an excess of pyruvate that has to be added and removed later via a cost-intensive down-stream processing step. In order to optimize the production of N-Acetyl neuraminic acid Trichoderma is used as whole-cell catalyst for the synthesis of N-Acetyl neuraminic acid, because Trichoderma itself provides phosphoenolpyruvate for the enzyme reaction. The use of Trichoderma as a whole-cell catalyst has the additional advantage that the strain Trichoderma atroviride can degrade chitin to its monomer N-Acetyl-glucosamine. This on the other hand is the substrate for the synthesis of N-Acetyl neuraminic acid when the relevant synthesis pathway has been introduced into Trichoderma atroviride after having been established in Trichoderma reesei first. In the course of this diploma thesis the enzymes N-Acetyl-glucosamine-2-epimerase from Anabaena sp. CH1 and N-Acetyl-neuraminic-acid-synthase from Campylobacter jejuni were inserted into Trichoderma reesei to optain a two-enzyme catalyzed pathway for the in vivo synthesis of N-Acetyl neuraminic acid. For that purpose the vectors needed for the transformation were constructed and the resulting transformants were analyzed to determine, whether the genes had been inserted. The recombinant Trichoderma reesei strains were further analyzed for the formation of transcript and enzyme activity in their cell-free extracts. Additionally the two enzymes were expressed as GST-fusion proteins in E. coli, in order to characterize them to determine the optimal temperature and incubation time.