Development of a novel approach to quantify trichothecene producing Fusarium species by quantitative PCR

Abstract

Der Befall von Getreide und Mais durch den pflanzenpathogenen Pilz Fusarium stellt eins der größten gegenwärtigen Probleme im modernen Pflanzenbau dar. Es führt zu erheblichen Ertragseinbußen und daraus folgend, zu massiven weltweiten Verlusten. Übergreifende Strategien zur Kontrolle von Fusarium verursachten Erkrankungen sind unabdingbar als Präventivmaßnahme. Obwohl die Resistenzzüchtung von Weizen im Laufe des letzten Jahrzehntes bedeutende Fortschritte gemacht hat, ist die Züchtung vollständig resistenter Sorten noch nicht gelungen. Die visuelle Bonitur in Kombination mit der analytischen Bestimmung des Mycotoxingehaltes mittels Massenspektrometrie sind herkömmliche Methoden zur Resistenzbewertung neuer Linien. Diese indirekten Methoden liefern keine Information über die Menge an gebildeter Pilzbiomasse. Einen neuen Ansatz zur Bestimmung des Befallsgrades in einer Pflanze bietet die quantitative PCR. Mit Hilfe der PCR wird die Menge an Fusarium DNA in einer Probe bestimmt. In dieser Arbeit wurde ein quantitativer PCR Test entwickelt, um Trichothecen-produzierende Fusarium Spezies zu detektieren. Die Methode wurde ferner für die Resistenzbewertung von neuen eizenlinien, künstlich infiziert mit Fusarium graminearum und Fusarium culmorum, adaptiert. Ein innovatives Referenzgensystem für eine präzisere Bestimmung von Fusarium-Biomasse wurde entwickelt, um unterschiedliche DNA Extraktionseffizienzen und Fragmentierung der isolierten DNA zu kompensieren. Um den Einsatz des Referenzgensystems zu verwirklichen, wurde eine Bestimmung der isolierten Fusarium DNA zusammen mit der Pflanzen DNA mittels spezifischen PCR Tests evaluiert. Da keine kommerziellen erhältlichen Standards vorhanden sind, ist die Herstellung geeigneter Template zur Quantifizierung von Fusarium DNA beziehungsweise Pflanzen DNA essentiell. Allerdings stellt die Entwicklung von DNA Standards eine große Herausforderung dar, da sie einen hohen Einfluss auf die PCR Ergebnisse haben.<br />Damit die Aussagen über den Fusariumbefall jedoch ausreichend zuverlässig werden, ist eine aufwändige Optimierung der gesamten Analyseprozedur unerlässlich. Der Einsatz des Referenzgensystems stellt eine neue Methode zur Bewertung von Fusarium-Resistenz in Pflanzen dar und wurde aus diesem Grund mit zwei bereits etablierten Methoden verglichen: Mykotoxinanalyse und visuelle Bonitur. Da in einigen Proben hohe Mengen an Deoxynivalenol-3-Glucosid nachgewiesen wurden, wurde der durch PCR bestimmte Infektionsgrad mit der Summe an Deoxynivalenol und Deoxynivalenol-3-Glucosid verglichen. Eine sehr gute Korrelation zwischen PCR bestimmtem Grad der Infektion und der Toxinmenge wurde beobachtet. Die Daten der visuellen Bonitur wichen besonders bei den resistenten Sorten oft deutlich von den beiden anderen Methoden ab. Im Zuge dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die Bestimmung des Infektionsgrades mit Fusarium mittels quantitativer PCR und die Mykotoxinanalyse zuverlässigere Ergebnisse für die Resistenzbewertung liefern als visuelle Bonitur.<br />

One of the main problems of agricultural industry producing cereals such as wheat, barley and maize is the fungal disease Fusarium head blight which has a massive economic impact worldwide. Integrated control strategies are essential to prevent Fusarium diseases in modern agriculture. Currently, plant breeders have made great progress in breeding Fusarium tolerant wheat lines.<br />However, total resistance to these plant pathogenic fungi has not yet been entirely achieved as the resistance genes are located on several distinct genetic regions. Common approaches to assess the tolerance of new lines include the analysis of mycotoxins with mass spectrometry in combination with visual scoring of disease symptoms. Nevertheless, both approaches are indirect methods to evaluate plant resistance and do not provide information concerning accumulated fungal biomass. Quantitative PCR is a useful tool to accurately determine biomass based on the amount of organism specific DNA. During this study a quantitative PCR assay for the detection of trichothecene producing Fusarium species was developed. The method was adapted for resistance assessment of wheat lines artificially infected with Fusarium graminearum and Fusarium culmorum. A new reference gene based approach in combination with quantitative PCR for more accurate quantification of Fusarium biomass in cereals was developed to compensate for unequal DNA extraction efficiencies or fragmentation of the isolated DNA, which have been shown to be the main drawbacks in recently published quantitative PCR approaches. To put the reference gene method into practice a co-determination of isolated Fusarium DNA and plant DNA with specific PCR tests was evaluated. As there are no commercial DNA-standards available it was essential to develop templates suitable as references for the quantification of fungal and plant DNA, respectively. However, developing such DNA templates presents a great challenge as PCR results are always highly influenced by the applied standards. The application of the PCR technique for the determination of the Fusarium resistance of plants represents a novel approach and the results were therefore compared with two well established methods: mycotoxin analysis and the visual scoring of Fusarium caused disease symptoms. As many samples show high levels of the masked mycotoxin deoxynivalenol-3-glucoside, the PCR determined infection was compared to the sum of deoxynivalenol and deoxynivalenol-3-glucoside and a high correlation between the methods could be observed. On the other hand, only a moderate correlation was present between the PCR determined degree of infection and the visual scoring of Fusarium caused disease symptoms, especially for highly resistant lines. The results of this study demonstrate that the determination of Fusarium resistance for the highly resistant lines might be more precise if it is based on the quantification of fungal DNA or on mycotoxin analysis rather than on visual scoring alone.