Development of a nanoelectrode enhanced MEA for fixation and measurement of human iPSC-derived cardioids

Abstract

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death worldwide. CVDs can alter the function and structure of the heart. To study the heart development and factors leading to CVDs, scientists have used both in vitro and in vivo models. To study the heart development, and to evaluate the proarrhythmia potential during drug development, primary and immortalized cell lines, both mammalian and human derived, have been used for decades as in vitro models. Cardiotoxicity is a major concern in drug development, therefore the ability to identify alterations of heart functions caused by drug candidates in early development stages is key. However, both animal and human derived cells are difficult to isolate, cultivate, and 2D models cannot replicate the complex physiological environment of the human heart. Recently, embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) have become a new tool for modeling cardiac diseases. Furthermore, patient derived iPSCs are used to generate 3D cardiac-like structures known as self-organizing heart cardioids. These 3D heart models have been used to model arrhythmogenic heart disorders and to perform new pharmaceutical compounds screening. Cardiomyocytes (CMs) are electrogenic cells and therefore electrophysiological methods can be used to evaluate the cardiotoxicity of pharmaceutical compounds. Up to now, technologies like 1) voltage sensitive dyes for optical imaging or 2) recording intracellular action potentials with patch-clamping have been used to evaluate drug toxicity in the heart. However, these techniques can alter the biology of cells and compromise their validity as heart models. To overcome these shortcomings this thesis proposes a novel fabrication technique for a nanoelectrode enhanced microelectrode array (MEA) with an integrated fixation system on a transparent substrate. With this MEA on a transparent substrate a simultaneous measurement of electrophysiological and optical signals is possible. Additionally, the fixation of cardioids by suction pressure mitigates movement artefacts, and increases the signal to noise ratio. The signal to noise ratio is also improved by the use of nanoelectrodes for MEAs measuring the electrophysiological signals. To fabricate the nanoelectrodes, direct-write deposition by focused electron beam induced deposition (FEBID) was chosen. These FEBID depositions are functionalized to become conductive needle electrodes with a circumventing insulating coating by micro and nanofabrication processes. Metal layer deposition, insulator layer deposition, and etching processes are combined to fabricate an electrically functional MEA. The functionality of the MEA chips and nanoelectrodes are demonstrated by electrophysiological measurements of organoids derived from human induced pluripotent stem cells. With these chips and cardiomyocyte organoids the usability was tested and successfully demonstrated. Finally, a low-cost reproduction technique for these MEA chips is achieved through nanoimprinting. By subsequent functionalization with metal layer and insulation layer functionalized nanoimprinted structures are achieved.

Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) sind weltweit die häufigste Todesursache. Herz-Kreislauf-Erkrankungen können die Funktion und Struktur des Herzens verändern. Zur Untersuchung der Herzentwicklung und der Faktoren, die zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen führen, verwende Wissenschaftler sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Modelle. Zur Untersuchung der Herzentwicklung und zur Bewertung des Proarrhythmiepotenzials bei der Arzneimittelentwicklung werden seit Jahrzehnten primäre und immortalisierte Zelllinien von Säugetieren und Menschen als In-vitro-Modelle verwendet. Kardiotoxizität ist ein Hauptproblem bei der Entwicklung von Arzneimitteln, daher ist die Fähigkeit, durch Arzneimittelkandidaten verursachte Veränderungen der Herzfunktionen in frühen Entwicklungsstadien zu erkennen, von entscheidender Bedeutung. Sowohl tierische als auch menschliche Zellen sind jedoch schwierig zu isolieren und zu kultivieren, und 2D-Modelle können das komplexe physiologische Umfeld des menschlichen Herzens nicht nachbilden. In jüngster Zeit haben sich embryonale Stammzellen (ESC) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) zu einem neuen Werkzeug für die Modellierung von Herzerkrankungen entwickelt. Darüber hinaus werden von Patienten stammende iPSC verwendet, um herzähnliche 3D-Strukturen zu erzeugen, die als selbstorganisierende Herzkardioide bekannt sind. Diese 3D-Herzmodelle werden für die Modellierung von Herzrhythmusstörungen und für das Screening neuer pharmazeutischer Wirkstoffe verwendet. Kardiomyozyten (CMs) sind elektrogene Zellen und daher können elektrophysiologische Methoden zur Bewertung der Kardiotoxizität von pharmazeutischen Wirkstoffen eingesetzt werden. Bislang wurden Technologien wie 1) spannungsempfindliche Farbstoffe für die optische Bildgebung oder 2) die Aufzeichnung intrazellulärer Aktionspotenziale mit Patch-Clamping zur Bewertung der Toxizität von Arzneimitteln im Herzen eingesetzt. Diese Techniken können jedoch die Biologie der Zellen verändern und ihre Gültigkeit als Herzmodelle beeinträchtigen. Um diese Unzulänglichkeiten zu überwinden, wird in dieser Arbeit ein neuartiges Herstellungsverfahren für ein mit Nanoelektroden erweitertes Mikroelektroden-Array (MEA) mit einem integrierten Fixierungssystem auf einem transparenten Substrat präsentiert. Mit diesem MEA auf einem transparenten Substrat ist eine gleichzeitige Messung von elektrophysiologischen und optischen Signalen möglich. Die Fixierung der Kardioide durch Saugdruck mildert zudem Bewegungsartefakte und erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis. Das Signal-Rausch-Verhältnis wird auch durch die Verwendung von Nanoelektroden für MEAs zur Messung der elektrophysiologischen Signale verbessert.Zur Herstellung der Nanoelektroden wurde die Direktschreibabscheidung durch fokussierte elektronenstrahlinduzierte Abscheidung (FEBID) gewählt. Diese FEBID-Abscheidungen werden durch Mikro- und Nanofabrikationsprozesse zu leitfähigen Nadelelektroden mit einer isolierenden Ummantelung funktionalisiert. Metallschichtabscheidung, Isolatorschichtabscheidung und Ätzprozesse werden kombiniert, um ein elektrisch funktionales MEA herzustellen. Die Funktionalität der MEA-Chips und Nanoelektroden wird durch elektrophysiologische Messungen an Organoiden aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen nachgewiesen. Mit diesen Chips und Kardiomyozyten-Organoiden wurde die Verwendbarkeit getestet und erfolgreich nachgewiesen. Schließlich wird eine kostengünstige Reproduktionstechnik für diese MEA-Chips durch Nanoimprinting erreicht. Durch die anschließende Funktionalisierung mit einer Metallschicht und einer Isolationsschicht werden funktionalisierte Nanoimprinting-Strukturen erreicht.