Einfluss von Gamma-Sterilisation auf dezellularisierten Knorpel

Abstract

Aufgrund der geringen Regenerationsfähigkeit von Knorpel gibt es viele Herausforderungen bei der Suche nach einer geeigneten Methode zur Knorpelregeneration. Ein neues und vielversprechendes Feld ist die Verwendung von dezellularisierten Knorpelgerüsten, die in der Lage sind, die Zusammensetzung und die Architektur des hyalinen Knorpels zu imitieren.AuriScaff ist ein enzymatisch perforiertes bovines Ohrknorpelgerüst, das über leere elastische Faserkanäle mit Zellen besiedelt werden kann. Damit Medizinprodukte in Kliniken eingesetzt werden können, müssen sie einen bestimmten Grad der Dezellularisierung erreichen und sich in einem aseptischen Zustand befinden. Um dieses Ziel zu erreichen, können verschiedene Sterilisationsverfahren durchgeführt werden, die sich in chemische und physikalische Sterilisation unterscheiden. Eine der bekanntesten physikalischen Sterilisationsmethoden ist die Gammabestrahlung, bei der für Biomaterialien üblicherweise eine Standarddosis von 25 kGy angegeben wird.Das Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss der Gamma-Sterilisation auf AuriScaff in Bezug auf Veränderungen der Matrixzusammensetzung und -struktur, der mechanischen Eigenschaften und der Zellinfiltration zu zeigen.Matrixveränderungen wurden durch histologische Färbungen (AZAN und Kollagen Typ II) untersucht. Darüber hinaus wurde ein Rasterelektronenmikroskop (SEM) verwendet, um die Mikrostruktur zu bewerten. Um die Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften zu analysieren, wurden Drucktests durchgeführt. Die Zellinfiltration und chondrogene Differenzierung von Stomazellen aus Fettgewebe (ASC/TERT1) wurde mit Hilfe histologischer Färbungen sowie eines konfokalen Mikroskops mit fluoreszierenden Zellen beobachtet.Zwei kommerziell erhältliche Scaffolds wurden mit AuriScaff verglichen. A) Spongostan - ein Gerüst auf Gelatinebasis. B) Tissue Fleece - ein Gerüst auf Kollagenbasis. Darüber hinaus wurden die Matrixveränderungen und die mechanischen Eigenschaften des AuriScaff und des nativen Ohrknorpels mit und ohne Gamma-Sterilisation untersucht. Es wurde ein Experiment mit konditioniertem Medium durchgeführt, um zu analysieren, ob die verschiedenen Scaffolds mit und ohne Gammasterilisation einen Einfluss auf die Zellpellets hatten, wie z.B. zytotoxische Wirkungen und Verbesserung oder Hemmung der Chondrogenese..Die Studie zeigte, dass die Gamma-Sterilisation zu einer Verringerung des Durchmessers und der Breite der Scaffolds führt. Im AuriScaff führte die Gamma-Sterilisation zu einer Veränderung der Matrix - eine blasige Struktur der Matrix, die eine hohe Zellinfiltration ermöglichte, während die kommerziellen Scaffolds ihre Matrixstruktur nicht verändert haben.Es konnte auch eine Veränderung der mechanischen Eigenschaften festgestellt werden, wobei der Kompressionsmodul des nativen Ohrknorpels und von AuriScaff nach der Gammasterilisation anstieg und der Kompressionsmodul der kommerziellen Scaffolds durch die Gammasterilisation abnahm. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Gammasterilisation die Matrixzusammensetzung der dezellularisierten Knorpelgerüste beeinflusst und die mechanischen Eigenschaften aller Scaffolds verändert.

Due to the low regeneration ability of cartilage, there are a lot of challenges in finding the appropriate method for cartilage regeneration. A relatively novel and promising field is the use of decellularized cartilage scaffolds, which have the ability to mimic the composition and architecture of hyaline cartilage.AuriScaff is an enzymatically perforated bovine auricular cartilage scaffold, which can be repopulated with cells via empty elastic fiber channels. To go into clinics with medical devices, they need to reach a specific amount of decellularization and be in an aseptic state. To achieve this goal, various sterilization methods can be performed, which differ in chemical and physical sterilization. One of the most prominent physical sterilization methods is gamma irradiation, where a standard dose of 25 kGy is commonly reported for biomaterials.The goal of this thesis is to show the influence of gamma sterilization on AuriScaff in terms of changes in the matrix composition and structure, mechanical properties, and cell infiltration.Matrix changes were studied by histological staining’s such as AZAN and collagen type II. Furthermore, a scanning electron microscope (SEM) was used to evaluate the microstructure. To analyze differences in the mechanical properties, compression tests were performed. The cell infiltration and chondrogenic differentiation of adipose derived stomal cells (ASC/TERT1) was observed using histological staining and a confocal microscope with fluorescently stained cells.Two commercially available scaffolds were compared to AuriScaff. A) Spongostan – a gelatin-based scaffold. B) Tissue fleece – a collagen-based scaffold. In addition, the matrix changes, and the mechanical properties of AuriScaff and native auricular with and without gamma treatment were studied. A conditioned media experiment was performed to analyze whether the different scaffold types with and without gamma-sterilization had an influence on cell (ASC/TERT1) in pellet culture, such as their viability or chondrogenesis.The study showed that gamma sterilization leads to a decrease in the scaffold’s diameters and widths. In AuriScaff the gamma-sterilization performed matrix changes – a bubbly structure of the matrix, which allowed a high cell infiltration while commercial ones didn’t change their matrix structure.Also, a change in mechanical properties could be seen, where the compression modulus of native auricular cartilage and AuriScaff was increased after gamma sterilization and the compression modulus of the commercial scaffolds was decreased with gamma sterilization. To summarize this investigation, gamma sterilization influenced the matrix composition of decellularized cartilage scaffolds and changed the mechanical properties of all scaffold types.