Osteopontin - a potential modulator of subtype identity in pancreatic cancer

Abstract

tumor microenvironment. These interactions which have been described in multiples tumors, make OPN a potential modulator of subtype identity in PDAC. However, knowledge of its effects in PDAC is very limited and based mostly on results from cancer cell lines 1–3. In this thesis I aim to investigate a potential subtype switch upon OPN modulation using a model of patient-derived pancreatic cancer organoids. Additionally, I am to elucidate the involved mechanisms. Organoids retain the transcriptional and genomic heterogeneity of PDAC and are therefore a very well-suited model to explore the effects of OPN 4. To analyze the effect of OPN on classical organoids, I treated two classical organoid lines with recombinant OPN, which led to an upregulation of basal-like markers. In addition, treatment of a classical organoid line with conditioned medium from a basal-like organoid line showed a similar effect, indicating the subtype alternating effects of cytokines secreted by basal-like tumor cells. I further wanted to explore whether knocking out OPN would reduce the basal-like signature in a basal-like organoid line. Therefore, I performed a CRISPR/Cas9 mediated OPN ablation in a basal-like organoid line, which led to a strong increase of classical subtype markers, suggesting that OPN is necessary to maintain a basal-like state. However, in a chemotherapeutic drug test, the OPN ablation did not affect the response to standard chemotherapy significantly. Therefore, OPN seems to play a relevant role in the subtype modulation; however, potential effects on chemotherapeutic resistance might be dependent on additional factors, including the tumor microenvironment which is lacking in this in-vitro model.In summary, the present work provides evidence of a subtype-modulating role of OPN in a patient derived organoid model and nominates OPN as a previously unrecognized potential target in the treatment of PDAC.

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) ist eine der tödlichsten malignen Erkrankungen weltweit, welches sich durch eine späte Diagnose, begrenzte Behandlungsmöglichkeiten und somit einer schlechten Prognose auszeichnet. Mittels RNA-Sequenzierung können zwei transkriptionellen Subtypen unterschieden werden: der klassische Subtyp (classical subtype) und der basale Subtyp ( basal-like subtype). Der classical Subtyp zeichnet sich durch einen epithelien Phänotyp und eine hohe GATA6-Expression aus, während der basal-like Subtyp mit einer epithelial-mesenchymalen Transition und einer niedrigeren histologischen Differenzierung assoziiert ist. Die Klassifizierung des Subtyps erweist sich als klinisch bedeutsam, da der basal-like Subtyp ein schlechteres Gesamtüberleben und ein schnelleres Fortschreiten der Krankheit aufweist. Dieses Wissen kann jedoch nicht in der personalisierten Medizin genutzt werden, da die entscheidenden Wechselwirkungen für das Wechseln des Subtyps noch unbekannt sind. Kürzlich wurde mittels Zelllinien und Xenografte beschrieben, dass der Transkriptionsfaktor GLI2 und sein nachgeschalteter Effektor Osteopontin (OPN) die Subtypausprägung beeinflussen. In diesem Modell kann der GLI2-OPN einen basal-like Zustand induzieren und aufrechterhalten 1. OPN selbst ist ein äußerst vielseitiges Protein, das in verschiedenen biologischen Systemen wirkt. Neben seiner Rolle bei der Knochenentwicklung oder bei der Initiierung der Immunantwort wird OPN zunehmend mit dem Fortschreiten von Krebserkrankungen in Verbindung gebracht. Es ist weiterhin an der Induktion der epithelialen-mesenchymalen Transition beteiligt, vermutlich durch Interaktion mit verschiedenen EMT-Signalwegen und durch die Aktivierung der Tumormikroumgebung. Diese Wechselwirkungen, die bei einer Vielzahl von Tumoren beschrieben wurden, machen OPN zu einem potenziellen Modulator der Subtyp-Identität bei PDAC. Das Wissen über seine Wirkung bei PDAC ist jedoch sehr begrenzt und basiert vor allem auf Experimenten in Zelllinien 1–3.In dieser Arbeit versuche ich ein besseres Verständnis vom Einfluss von OPN auf den Tumor Subtyp in PDAC zu bekommen. Hierzu nutze ich ein humanes Organoidmodell des Pankreaskarzinoms, welches aus Tumorproben von Patienten etabliert wurde. Organoide repräsentieren den Tumor deutlich besser als eine klonale Ziellinie, insbesondere durch die Beibehaltung der genomischen und transkriptionellen Heterogenität 4. Um die Wirkung von OPN auf classical Organoide zu analysieren, habe ich zwei classical Organoid Linien mit rekombinantem OPN behandelt. Eine anschließende Analyse zeigte eine Hochregulierung von basal-like Markern. Darüber hinaus zeigte die Behandlung einer klassischen Organoid Linie mit konditioniertem Medium einer basal-ähnlichen Organoid Linie einen ähnlichen Effekt. Damit konnte gezeigt werden, dass basal-like Organoide Subtyp alternierende Zytokine ausschütten. Die andere Forschungsfrage war, ob ein OPN Knock-Out (KO) die basal-like Signatur in einer basal-like Organoid Linie reduzieren würde. Daher führte ich mittels CRISPR/Cas9 eine OPN-Ablation in einer basal-like Organoid Linie durch. Hier konnte ich einen starken Anstieg der Marker des classical Subtyps nachweisen, was darauf hindeutet, dass OPN für die Aufrechterhaltung eines basal-like Zustands notwendig ist. Eine Testung auf Resistenz gegenüber Chemotherapeutika zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen dem OPN KO und der Wildtyp-Linie. OPN scheint also eine wichtige Rolle bei der Modulation des Subtyps zu spielen, jedoch mögen weitere Faktoren einen möglichen Effekt auf die Chemotherapiesensitivität beeinflussen, u.a. das Tumormikromilieu. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die wichtige Rolle von OPN für den Erhalt eines basal-like Subtypen auf und liefert weitere Gründe für die Annahme, dass OPN ein mögliches Wirkstoffziel für die Behandlung von PDAC sein könnte.