Characterisation of proteins derived from Malus domestica

Abstract

Phloretin und Phloridzin sind derzeitig aufgrund ihrer positiven Wirkung auf das menschliche Befinden in den Fokus von Gesundheitsund Krebsforschung gerückt. Beide Komponenten sind in unterschiedlichen Mengen in den Pflanzen der Familie Rosaceae vorhanden, vor allem in Malus domestica, der die höchste Menge an diesen Polyphenolen beinhaltet. Der Biosyntheseweg von Phloretin ist aufgrund der Anwesenheit von mehreren möglichen (Ausgangs-)Substraten noch nicht vollkommen aufgeklärt. Ähnlich verhält es sich mit den Enzymen, die für die Bildung von Phloretin nötig sind. Für die Identifizierung dieser spezifischen Enzyme, wurden Proteine von jungen Apfelblättern (M. domestica cv. Golden Delicious) mittels wässriger zwei-Phasen Extraktion sowohl mit Triton X-114 als auch mit PEG4000, extrahiert und isoliert. Die Aufreinigung der Proteine erfolgte mittels Schnell-Leistungs-Flüssig-Chromatographie (fast protein liquid chromatography, FPLC) anhand von drei aufeinanderfolgenden starken Kationenaustauschersäulen. Proben von den verschiedenen chromatographischen Aufreinigungsschritten wurden genommen und anhand von Gel-Kapillarelektrophorese auf einem Chip mit integriertem Laser-induzierten Fluoreszenz Detektor analysiert, um die Proteinmenge in den Proben zu ermitteln als auch die Aufreinigungsschritte an sich nachzuverfolgen und zu vergleichen. Für die Protein Identifizierung wurde eine Peptidmassenfingerprint-Analyse (PMF) durchgeführt. Dafür wurde ein 1D SDS-PAGE mit mehreren Replikaten der Proben durchgeführt, um verlässliche Daten zu generieren. Anschließend wurden die Gele mit einer Massenspektrometrie-kompatiblen Silberfärbung eingefärbt, die acht Hauptbanden wurden ausgeschnitten und mit einer Trypsin/LysC Mischung wurde ein In-gel Verdau durchgeführt. Des Weiteren wurde eine zweite Herangehensweise des In-Gel Verdau mit höheren Konzentrationen an Ameisensäure und Acetonitril durchgeführt, um hydrophobere Peptide zu extrahieren. Die extrahierten trypsin/LycC-generierten Peptide wurde anhand von einem ZipTip (C18 Material) Aufreinigungsschritt gereinigt und anschließend mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation (MALDI) Reflektron (RTOF) und MALDI-Linearflugzeit (LTOF)/RTOF Massenspektrometrie (MS) analysiert, um Massenspektren als auch Tandem-Massenspektren (MS2) zu erhalten. Die erhaltenen PMF Daten als auch die MS2 Daten wurden für die Suche in der Mascot Search Engine (ein Suchalgorithmus), in der die Daten mit in-silico verdauten Proteinen verglichen und zugeordnet werden, verwendet. Infolge dessen konnten drei von acht Gelbanden mit einer Signifikanz von 95% identifiziert werden alpha-xylosidase 1-like, cucumisin-like Isoform X1 und X2 sowie beta-glucosidase 12-like oder deren Isoformen X1 und X2. Das ursprünglich vorgeschlagene Enzym konnte allerdings nicht identifiziert werden. Für eine eindeutige Identifizierung und Charakterisierung des vorgeschlagenen Enzyms oder der Enzyme bzw. Isoformen des Phloretin-Biosynthesewegs könnte zukünftig eine weitere Verbesserung der Proteinisolierung und -aufreinigung mit anschließender 2D Gelelektrophorese und MS erfolgen.

Phloretin and phloridzin are currently in the focus of health and cancer research due to their beneficial effects. Both compounds are found to a various degree in the plant family of Rosaceae, but especially in Malus domestica, which contains the highest amount of those polyphenols. The biosynthesis pathway of the formation of phloretin is not yet fully elucidated due to the presence of multiple possible substrates. Likewise, the enzyme(s) required for the formation is still not characterized and identified. For the identification of the specific enzyme(s) (i.e. protein(s)) were isolated and extracted from young apple leaves (M. domestica cv. Golden Delicious) using Aqueous Two-Phase System (ATPS) with Triton X-114 as well as PEG 4000. The purification of the protein(s) was achieved with Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) using three successive strong cation exchange columns. Samples from the different chromatographic steps were taken and analyzed by means of a capillary electrophoresis-on-a-chip system with an integrated laser-induced fluorescence detection to determine the protein amount in the samples and to monitor the purification steps of the protein sample. For protein identification a Peptide Mass Fingerprint (PMF) approach was performed. Therefore, a 1D SDS-PAGE was done with replicates of the sample to provide reliable results. The gels were stained with a mass spectrometry-compatible silver approach. Subsequently, eight gel bands were excised and in-gel digestion using a trypsin/Lys C mixture was performed. Moreover, a second in-gel digestion approach with higher amounts of formic acid (FA) and acetonitrile (ACN) was performed to extract more hydrophobic peptides. The extracted tryptic peptides were purified with ZipTip pipette tips (C18 material) and subsequently analyzed with Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Reflectron Time-Of-Flight (MALDI RTOF) and MALDI TOF/RTOF mass spectrometer (MS) to obtain mass spectra as well as tandem mass spectra (MS2). The acquired PMF data and MS2 data were applied to search with the Mascot Search engine to compare and match the data to in-silico digested proteins. As a result, three out of eight analysed gel bands were identified with a 95% probability of significance alpha-xylosidase 1-like, cucumisin-like isoform X1 or X2, beta-glucosidase 12-like or isoforms X1 or X2. However, the originally suggested protein of interest could not be identified. In the future, further improvement of protein isolation and purification will be required as well as an approach with 2D gel electrophoresis and MS should be performed to be able to identify unambiguously the protein(s) related to phloretin biosynthesis and characterize it (them).