Investigation of liver-stellate cell activation and the role of lipolysis in the activation process

Abstract

Liver cancer combines the worrying characteristics of an increasing prevalence and a strikingly low 5-year survival rate of 20 % (data for USA only). Liver cancer is strongly connected to other liver diseases like fibrosis and cirrhosis and can be caused by alcohol consumption, toxin ingestion or progressive forms of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). This fact represents a significant concern given the globally rising obesity rates. Various conditions are summarized under the term NAFLD, some of which induce liver inflammation which, if unresolved over long times, activates hepatic stellate cells (HSC). Activation of formerly quiescent, retinol storing HSC leads to loss of intracellularly stored lipid droplets and transdifferentiation into myofibroblast-like cells. Most prominently, activated HSC are the main driving force in liver fibrosis due to intense deposition of extracellular fibrotic proteins. Thus, understanding activation and possible reversion of HSC is key in understanding liver diseases like fibrosis. To elucidate pathways involved in HSC activation and reversion we used the LX-2 cell line in proteomics experiments. In vitro activation was achieved by incubation with 10 % fetal bovine serum (FBS) or transforming growth factor beta (TGF-beta) while cells were deactivated by removing these agents again. To specifically target the role of adipose triglyceride lipase (ATGL) in HSC activation, we treated serum activated LX-2 cells with the (small-molecule) ATGL inhibitor NG-497. ATGL is a triacylglycerol lipase heavily involved in the degradation of lipid droplets during HSC activation.We identified TGF-beta as more robust method of LX-2 cell activation and confirmedphenotypical changes via significantly higher expression rates of extracellular matrix proteins and proteins involved in cellular migration and cytoskeletal organisation. Changes in metabolic pathways were inconclusive and may have been influenced by the use of FBS.We revealed that quiescent LX 2 cells exhibit only minor differences when ATGL was inhibited, while serum activated LX-2 cells showed major dependency on ATGL activity. Data allows the interpretation that inhibiting ATGL could result in less pronounced phenotypes of activated HSC by disrupting energy yielding pathways, starving the cells out in the process. However, signalling effects of PPAR alpha and -delta due to inactivation of ATGL could also be responsible for this effect. In conclusion we laid a solid ground for further analysis of HSC cell activation. Especially, phenotypical analysis including proliferation and lipid droplet volume as well as further analysis focusing on lipid metabolism of activated LX-2 cells would help to reveal the complex processes involved in liver diseases like fibrosis.

Leberkrebs vereint steigende Prävalenz mit einer auffallend niedrige 5-Jahres-Überlebensrate von 20 % (Daten von USA). Leberkrebs steht in enger Verbindung zu anderen Lebererkrankungen wie Fibrose und Zirrhose und kann durch Alkoholkonsum, Toxin Aufnahme oder fortschreitende Formen der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) verursacht werden. Diese Tatsache stellt angesichts der weltweit steigenden Fettleibigkeitsraten ein erhebliches Problem dar. Unter dem Begriff NAFLD werden verschiedene Zustände zusammengefasst, von denen einige eine Leberentzündung hervorrufen, welche auf Dauer hepatische Sternzellen (HSC) aktiviert. Diese Aktivierung von ruhenden, Retinol speichernden HSC führt zum Verlust von intrazellulär gespeicherten Lipidtropfen und zur Transdifferenzierung in Myofibroblast-ähnliche Zellen. Aufgrund der intensiven Ablagerung von fibrotischen Proteinen sind aktivierte HSC die treibende Kraft bei der Entstehung von Leberfibrose. Daher ist das Verständnis über Aktivierung und möglichen Deaktivierung von HSC entscheidend für das Verständnis von Lebererkrankungen wie Fibrose. Um beteiligte Signalwege aufzudecken, haben wir in Proteomik-Experimenten die Zelllinie LX-2 verwendet. HSC wurden durch Inkubation in 10 % fötalem Kälberserum (FBS) oder Transforming Growth Factor Beta (TGF-β) aktiviert. Deaktiviert wurden die Zellen durch Entfernen dieser Substanzen. Um die Rolle der Adipozyten-Triglycerid-Lipase (ATGL) bei der HSC-Aktivierung zu analysieren, haben wir serumaktivierte LX-2-Zellen mit dem (kleinmolekularen) ATGL- Inhibitor NG-497 behandelt. ATGL ist eine Triacylglycerol-Lipase, welche während der HSC-Aktivierung maßgeblich am Abbau von Lipidtropfen beteiligt ist.Wir haben TGF-β als robustere Methode zur Aktivierung von LX-2-Zellen identifiziert und konnten phänotypische Veränderungen durch signifikant höhere Expressionsraten bestätigen. Dies betrifft die Produktion von extrazellulären Matrixproteinen und Proteinen, die an Prozessen der zellulären Migration und zytoskelettaler Organisation beteiligt sind. Metabolische Veränderungen waren nicht eindeutig und könnten durch die Verwendung von FBS beeinflusst worden sein. Wir haben festgestellt, dass ruhende LX-2-Zellen nur geringfügige Veränderungen aufweisen, wenn ATGL gehemmt wird, während serumaktivierte LX-2-Zellen eine starke Abhängigkeit gegenüber ATGL-Aktivität zeigen. Die Daten legen nahe, dass die Hemmung von ATGL zu weniger ausgeprägten Phänotypen von aktivierten HSCs führen könnte, indem energieliefernde Prozesse gestört werden, was die Zellen aushungern könnte. Allerdings könnten auch die Signalwirkungen von PPAR-α und -δ durch Inaktivierung von ATGL für den beobachteten Effekt verantwortlich sein. Zusammenfassend haben wir eine solide Grundlage für weitere Analysen der LX-2-Aktivierung geschaffen. Vor allem phänotypische Analysen bezüglich Proliferation und Fetttröpfchenvolumen sowie weitere Analysen des Fettstoffwechsels von aktivierten LX-2-Zellen würden bei der Aufklärung von komplexen Prozessen während Lebererkrankungen wie Leberfibrose helfen.