Transcription factor engineering for the activation of biosynthetic gene clusters

Abstract

Sekundärmetabolite aus Pilzen sind bioaktive Verbindungen, die in biosynthetischen Genclustern im Pilzgenom kodiert sind. Diese Gencluster stellen eine Quelle versteckter Schätze dar, wenn man die Vielfalt der Bioaktivitäten der entstehenden Metaboliten bedenkt. Die aus diesen Clustern stammenden Metabolite werden in unserer modernen Welt hauptsächlich in der Medizin, aber auch zur Färbung von Lebensmitteln und Textilien verwendet. Viele dieser Cluster bleiben unter Standardlaborbedingungen oft stumm und werden nur aktiviert, wenn der Pilz sie braucht. Der Organismus aktiviert sie nur, wenn er eine bestimmte Aufgabe zu erfüllen hat, daher bleiben die Metaboliten oft unentdeckt. Eine wichtige Aufgabe der modernen Biotechnologie besteht daher darin, diese stillen Gencluster zu aktivieren und die daraus entstehenden Sekundärmetaboliten oder Derivate zu identifizieren und sie zu nutzen. In diesem Projekt wurden bioinformatische Analysen am Genom von Trichoderma reesei QM6a durchgeführt und 91 biosynthetische Gencluster entdeckt. Vier davon wurden aufgrund ihres Aufbaus und ihres potenziellen Metaboliten zur Aktivierung ausgewählt. Es wurden fünf synthetische Transkriptionsfaktorkassetten (syn) entworfen, die eine verkürzte DNA-Bindungsdomäne enthalten, welche mit der transaktivierenden Domäne eines anderen Gens fusioniert ist. Klassische Klonierungsansätze ebneten den Weg zur Transformation dieser Kassetten in T. reesei und zusätzlich wurden T. reesei Stämme mit Überexpressionskassetten (OE) transformiert, die den nativen Transkriptionsfaktor enthielten. Nach der Kultivierung mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle wurden Transkriptionsanalysen mittels qPCR durchgeführt und die wichtigsten biosynthetischen Schlüsselgene jedes Clusters analysiert. Es gelang uns drei von vier BGCs zu aktivieren: Ein Cluster wurde in beiden Arten von Transformanten (OE und syn) aktiviert, ein Cluster nur in syn-Transformanten und der dritte Cluster nur in OE-Transformanten. Darüber hinaus haben wir das Co-expressionsverhalten von bestimmten Genen in diesen drei aktivierten Clustern analysiert. Alle, als wichtig für die Cluster vorhergesagten Gene, die analysiert wurden waren stark co-exprimiert. Zukünftige Aufgaben bestehen darin, die produzierten Sekundärmetaboliten zu identifizieren, zu isolieren und auf ihre biochemischen Eigenschaften zu testen.

Fungal secondary metabolites are small bioactive compounds that are encoded in biosynthetic gene clusters in the fungal genome. These gene clusters are a source of undiscovered treasures, considering the bioactivities of the resulting metabolite. The metabolites from these clusters are mainly used as treatment in medical applications but also for food- and textile coloring in our modern world. Many of these clusters often remain silent under standard laboratory conditions and the organism only activates them when it needs to perform a certain task. Hence the metabolites often remain undiscovered. A major task in modern biotechnology is therefore to activate these silent gene clusters, identify the resulting secondary metabolite or derivate and utilize them. In this project, bioinformatic analyses on Trichoderma reesei QM6a’s genome was performed and 91 biosynthetic gene cluster were discovered. Four were chosen for activation according to their organization and potential metabolite. Five synthetic transcription factor cassettes (syn) were designed, bearing a truncated DNA binding domain fused to the transactivating domain of another gene. Classic cloning approaches paved the way to transform these cassettes into T. reesei and additionally T. reesei strains were generated with overexpression cassettes (OE), which inherited the native transcription factor. After cultivation on glucose as sole carbon source, transcript analyses were performed via qPCR by targeting key core biosynthetic genes of each cluster. We were able to activate three out of four BGCs: One cluster was activated in both types of transformants (OE and syn), one cluster only in syn-transformants and the third cluster only in OE-transformants. Furthermore, we determined co-expression behavior of predicted genes in these three activated clusters. All analyzed core biosynthetic genes were highly co-expressed in the activated clusters. Future steps to come consist of identifying the produced secondary metabolites, isolate them and test them for their biochemical properties.