Biophysical characterisation of adeno-associated virus vectors using advanced analytical technologies

Abstract

Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind eines der am häufigsten verwendeten Transportsysteme bei Gentherapien zur Behandlung seltener Erkrankungen. Während der AAV-Produktion werden neben den gewünschten AAV-Kapsiden, die das Transgen von Interesse enthalten, auch Partikel mit Bruchstücken oder ohne genetisches Material produziert. Da diese Nebenprodukte potenziell gesundheitsgefährdend sind, gelten sie als Verunreinigungen und müssen zusammen mit verschiedenen anderen kritischen Qualitätsmerkmalen (CQAs), wie z. B. dem Kapsidtiter und der Integrität des viralen Genoms, sorgfältig überwacht werden, um die sichere und wirksame Anwendung des Gentherapeutikums zu gewährleisten. Heutzutage werden verschiedene Analysetechniken wie Größenausschlusschromatographie (SEC), analytische Ultrazentrifugation (AUC), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Ladungsdetektions-Massenspektrometrie (CDMS), qPCR oder ELISA gemeinsam zur Charakterisierung eines Gentherapieprodukts eingesetzt. Derzeit gibt es jedoch keine universelle Technik für die gleichzeitige Bestimmung mehrerer CQAs. Darüber hinaus sind die meisten dieser Methoden mit langen Durchlaufzeiten, geringem Probendurchsatz und komplexer Datenanalyse verbunden. In dieser Arbeit wurde ein neuartiges und robustes Ionenaustausch-Chromatographieverfahren gekoppelt an Lichtstreudetektoren für die umfassende Charakterisierung von leeren und gefüllten AAVs in Bezug auf Kapsidtiter, das Verhältnis von vollen zu Gesamtkapsid-Zahl, Größe der Partikel, Polydispersität und absolute Molmassen des Proteins und der Nukleinsäure entwickelt, wobei eine Basislinientrennung beider Subpopulationen vorder Datenanalyse entfällt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Massenphotometrie (MP) als schnelle und einfache orthogonale Technik zur AUC eingesetzt werden kann, um die Anteile leerer, teilweise gefüllter, voller und überfüllter Partikel in einer AAVProbe mit minimaler Probenvorbereitung, geringen Probenvolumina (5-10 uL) und kurzen Analysezeiten (1-2 Min.) genau zu quantifizieren. Um dies weiter auszubauen, wurde ein Aufreinigungsverfahren entwickelt, das auf monospezifischen Einzeldomänenantikörper basiert, die entweder auf einem Poly(styrol-divinylbenzol)- Harz oder auf magnetischen Beads immobilisiert sind. Dies ermöglicht die Bestimmung von AAV-Subpopulationen in Zellmaterial während der Entwicklung neuer Transfektionsbedingungen. Dies sollte bei der Auswahl vielversprechender Erntekonditionen (Transfektionsreagenz, Zelllinie, Transgen usw.) helfen, welche die größten Ausbeuten an gefüllten AAV-Kapsiden liefern, ohne dass aufwändigeReinigungsverfahren wie Diafiltration, Ultrazentrifugation oder chromatografische Trennverfahren erforderlich sind.

Adeno-associated viruses (AAV) are one of the most commonly used vehicles in gene therapies for the treatment of rare diseases. During the AAV manufacturing process, particles with little or no genetic material are co-produced alongside the desired AAV capsids containing the payload of interest. Due to potential adverse effects of these byproducts, they are considered impurities and require to be monitored thoroughly together with several other critical quality attributes (CQAs), such as capsid titer and viral genome integrity for example to ensure the safe and efficacious application of the gene therapeutic. Today, several analytical techniques, including size-exclusion chromatography (SEC), analytical ultracentrifugation (AUC), transmission electron microscopy (TEM), charge-detection mass spectrometry (CDMS), qPCR or ELISA, are used jointly for the characterisation of a gene therapy product. However, no universaltechnique for the simultaneous determination of multiple CQAs is currently available. Furthermore, most of these methods are associated with long-turnaround times, lack of high sample throughput and complex data analysis. In this study, a novel and robust ion-exchange chromatography method coupled to light scattering detectors was developed for the comprehensive characterisation of empty and filled AAVs concerning product titer, full-to-total ratio, capsid size, polydispersity, and absolute molar masses of the protein and nucleic acid omitting baseline-separation of both subpopulations prior to data analysis. Furthermore, it was demonstrated that mass photometry (MP) can be used as a fast and simple orthogonal technique to AUC to accurately quantify the proportions of empty, partially filled, full and overfull particles in an AAV samples with minimal sample preparation, low sample volumes (5-10 uL) and short analysis times (1-2 min.). To expand this further, a purification procedure was developed based on single-domain monospecific antibody fragments immobilised on either a poly(styrene-divinylbenzene) resin or on magnetic beads prior to MP analysis which enables the assessment of AAV subpopulations at early stages of the development platform within the upstream process. This should aid in selecting promising harvest conditions (transfection reagent, cell line, transgene, etc.) yielding high quantities of filled AAV capsids omitting cumbersome cleanup procedures such as diafiltration, ultracentrifugation or chromatography-based separation techniques.