Bioanalytical challenges for AAV8 application in gene therapy

Abstract

Diese Arbeit untersucht systematisch die Eigenschaften des Adeno-assoziierten Virus 8 und Virus-ähnlicher Partikel (AAV8 VLPs), die als Schlüsselelement im aufstrebenden Bereich der Gentherapie gelten. Die vorliegende Forschungsarbeit ist in drei Publikationen gegliedert, die jeweils einen einzigartigen Aspekt der AAV8-VLPs behandeln, welcher für deren Charakterisierung und den Einsatz in der Gentherapie von zentraler Bedeutung ist.Die erste Veröffentlichung (in ACS Omega) demonstriert die Anwendbarkeit des Nano-Elektrospray-Gasphasen-Elektrophorese-Mobilitäts-Molekularanalysators (nES GEMMA) zur Größenbestimmung von AAV8-VLPs und dessen Fähigkeit, zwischen leeren und gefüllten Kapsiden zu differenzieren. Weiters wird die asymmetrische Fluss-Feldflussfraktionierung (AF4) genutzt, um diese Bio-Nanopartikel zu trennen und ihre Reaktionen auf verschiedene Umweltstressfaktoren, wie Temperatur und Scherkräfte, zu analysieren. Die nachfolgende Untersuchung der Fraktionen mit nES GEMMA und Rasterkraftmikroskopie (AFM) ermöglicht die Identifizierung der Bildung von Dimeren, Trimeren und Oligomeren und erweitert damit unser Verständnis des Aggregationsverhaltens der VLPs unter Stressbedingungen.Die zweite Publikation (in Journal of Mass Spectrometry) setzt sich mit der vergleichenden Bestimmung des Molekulargewichts von leeren und gefüllten AAV8-VLPs auseinander. Dies wurde durch den Einsatz von nES GEMMA in Kombination mit nativer Massenspektrometrie (nMS) erzielt, wobei die Ergebnisse beider Methoden integriert wurden. Dieser kombinierte Ansatz ermöglichte eine präzisere Schätzung des Molekulargewichts für beide VLP-Typen. Die gewonnenen Erkenntnisse bereichern nicht nur das wissenschaftliche Verständnis, sondern unterstützen auch die Entwicklung von Gentherapien.Die dritte Veröffentlichung (in Viruses) untersucht die Reaktion von AAV8-VLPs auf pH-Veränderungen, insbesondere hinsichtlich Veränderungen des Durchmessers und Aggregationsverhaltens. Interessanterweise zeigen nES GEMMA und AFM spezifische Trends, während die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) gegenteilige Ergebnisse liefert. Diese Diskrepanz betont den Einfluss der analytischen Umgebung auf das Verhalten dieser Bio-Nanopartikel und hebt die Bedeutung eines multi-analytischen Ansatzes hervor. Diese Strategie ist für eine umfassende und genaue Charakterisierung von AAV8-VLPs sowie für das vertiefte Verständnis anderer Bio-Nanopartikel essenziell.Zusammenfassend zeigen die in dieser Dissertation vorgestellten Studien den erheblichen Wert des Einsatzes verschiedener analytischer Techniken, jeweils mit ihren spezifischen Stärken und Einschränkungen, auf und tragen gemeinsam dazu bei, unser Verständnis von AAV8-basierten viralen Vektoren zu erweitern.

This thesis methodically investigates the properties of Adeno-Associated Virus 8 Virus-Like Particles (AAV8 VLPs), a key player in the evolving field of gene therapy. The research work presented here is divided into three publications, each addressing a unique aspect of AAV8 VLPs, crucial for their characterization and application in gene therapy.The first publication (ACS Omega) establishes the feasibility of nano Electrospray Gas-phase Electrophoretic Mobility Molecular Analyzer (nES GEMMA) for measuring AAV8 VLPs, and its ability to differentiate between empty and filled capsids. It then applies Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) to fractionate these bio-nanoparticles and investigate their response after exposure to specific environmental stressors, such as temperature and shear stress. The subsequent analysis of the fractions using nES GEMMA and Atomic Force Microscopy (AFM) reveals the formation of dimers, trimers, and oligomers, thus enhancing our understanding of the VLPs' aggregation behavior under these stress conditions.The second publication (J Mass Spectrom) focuses on determining the molecular weight of empty and filled AAV8 VLPs. This was accomplished by initially employing nES GEMMA, followed by native Mass Spectrometry (nMS), and by integrating the results from both techniques. This integrated approach resulted in an improved molecular weight estimation for empty and filled AAV8 VLPs. These findings not only enrich scientific knowledge but also support the development of gene therapy applications.The third publication (Viruses) investigates the response of AAV8 VLPs to pH variations, specifically focusing on changes in diameter and aggregation behavior. Interestingly, nES GEMMA and AFM suggest specific trends, whereas Cryogenic Transmission Electron Microscopy (cryo-TEM) shows contrasting results. This discrepancy emphasizes the impact of the analytical environment on the behavior of these bio-nanoparticles, thus highlighting the necessity and importance of employing a multi-analytical approach. This strategy is essential for a comprehensive and accurate characterization of AAV8 VLPs and advancing our understanding of other bio-nanoparticles.To conclude, the studies presented in this thesis demonstrate the significant value of employing diverse analytical techniques, each with unique strengths and limitations, and collectively contribute to expanding our understanding of AAV8-based viral vectors.