Holotomographic microscopy of subcellular structures and nuclear dynamics in filamentous fungi

Abstract

Die Morphologie filamentöser Pilze wird durch Schlüsselereignisse, wie der Entstehung von Keimschläuchen, dem Hyphenwachstum sowie der Bildung apikaler und lateraler Verzweigungen bestimmt. Aspergillus niger ist ein Pilz, der häufig für die industrielle Herstellung von Zitronensäure verwendet wird. Wachstumsmerkmale wie die Bildung eines Hyphen-Netzwerks sind von großer Bedeutung, da sie die Sekretion der organischen Säure durch den Pilz beeinflussen. In dieser Hinsicht kann die Bildgebung lebender Zellen ein leistungsfähiges Instrument zur Untersuchung der Morphogenese des Pilzes sein. Die meisten konventionellen hochauflösenden Live-Cell-Imaging-Techniken erfordern jedoch entweder Fluoreszenzmarker oder können nicht für 3D-Imaging verwendet werden.In dieser Arbeit wurden die morphologischen Unterschiede zwischen dem A. niger Wildtyp ATCC 1015 und einem Zitronensäure-produzierenden Industriestamm (ACIB1) mit einem markierungsfreien Live-Cell-Imaging-System erfasst, das auf quantitativer Phasenbildgebung (QPI) basiert. Die Visualisierung erfolgte durch die Erstellung einer 3D-Brechungsindexkarte (RI map) der Probe mit Hilfe der holotomographischen Mikroskopie (HTM), einer Methode, die in den letzten Jahren häufig bei Säugetierzellen angewendet wurde. Darüber hinaus wurden subzelluläre Strukturen der Pilze A. niger, Aureobasidium pullulans und Trichoderma reesei untersucht. Organellenspezifische Fluoreszenzfarbstoffe oder GFP-markierte Proteine wurden verwendet, um die Identifizierung subzellulärer Strukturen auf der Grundlage charakteristischer RI-Muster zu ermöglichen. Weiters wurde Live-cell HTM mit Fluoreszenzbildgebung gekoppelt, um das Verhalten von Zellkernen und der Cyclin-abhängigen Kinase (CDK) NimXCdc2 von A. niger zu untersuchen. Genmodifikation wurden mittels Golden Gate cloning und einem in-vivo exprimierten CRISPR/Cas9-System durchgeführt.Auffällige subzelluläre Strukturen wie Lipidtropfen und Vakuolen konnten erfolgreich einem RI-Muster zugeordnet werden. Darüber hinaus wurde bestätigt, dass die Zellwand von Pilzen die Visualisierung von Zellinhalten mittels HTM erheblich beeinträchtigt. Eine detaillierte RI-Karte, wie sie für Säugetierzellen erhalten wurde, kann daher für Pilze ohne Berücksichtigung der Pilzzellwand nicht erreicht werden. Die allgemeine Anwendbarkeit von HTM auf Pilze wurde jedoch demonstriert und morphologische Analysen zeigten signifikante Wachstumsunterschiede zwischen dem A. niger Wildtyp-Stamm und dem Zitronensäureproduzenten. Außerdem wurde eine synchrone Kernteilung in apikalen Hyphenkompartimenten beobachtet. Die Untersuchung der GFP-markierten CDK NimXCdc2 zeigte eine Akkumulation in den Kernen zu bestimmten Zeitpunkten. Das Fehlen der Kernteilung im GFP-Signal deutet darauf hin, dass sich NimXCdc2 während der Zytokinese nicht im Zellkern befindet.

The morphology of filamentous fungi is determined by key events including the emergence of germ tubes, hyphal elongation as well as the formation of apical and lateral branches. Aspergillus niger is a fungus commonly used in the industrial production of citric acid. Growth characteristics such as the formation of a hyphal network are of great importance as they influence the secretion of the organic acid by the fungus. In this respect, live-cell imaging can be a powerful tool to study the morphogenesis of the fungus. However, most conventional high-resolution live-cell imaging techniques either require fluorescent markers or cannot be used for 3D imaging.In this work, morphological differences of Aspergillus niger wild type ATCC 1015 and an improved industrial citric acid producing strain (ACIB1) were captured using a label-free live-cell imaging system based on quantitative phase imaging (QPI). Visualization was performed by creating a 3D refractive index (RI) map of the sample using holotomographic microscopy (HTM), a method that has been frequently applied to mammalian cells in recent years. In addition, subcellular structures of the fungi A. niger, Aureobasidium pullulans, and Trichoderma reesei were targeted. Organelle-specific fluorescent dyes or GFP-tagged proteins were used to allow identification of subcellular structures based on characteristic RI patterns. Furthermore, live-cell HTM coupled with fluorescence imaging was performed to investigate nuclear dynamics and the cyclin-dependent kinase (CDK) NimXCdc2 of A. niger. Genetic engineering was performed with Golden Gate cloning and an in-vivo expressed CRISPR/Cas9 system. Prominent subcellular structures such as lipid droplets and vacuoles were successfully assigned to an RI pattern. In addition, it was confirmed that the fungal cell wall significantly affects the visualization of cellular contents with HTM. Thus, a detailed RI map as obtained for mammalian cells cannot be achieved for fungi without considering the fungal cell wall. However, the general applicability of HTM on fungi was demonstrated and morphological analyses revealed significant differences in growth between the A. niger wild type strain and the citric acid producer. Furthermore, synchronous nuclei division in apical hyphal compartments was observed. The investigation of the GFP-tagged CDK NimXCdc2 showed an accumulation in the nuclei at certain time points. The absence of nuclear division in the GFP signal suggests that NimXCdc2 is not located in the nucleus during cytokinesis.