Pharmacological screening of oxytocin-like peptides at human receptors

Abstract

G protein-coupled receptors (GPCRs) are essential for numerous physiological processes and therefore considered majorly important drug targets. Upon ligand stimulation, they can activate different G proteins or beta-arrestins. However, the molecular mechanisms determining the activation of specific GPCR subtypes and their intracellular signaling remain elusive. GPCR ligands often bind to several receptors and signal through multiple pathways, challenging the development of selective drugs. This project thus aims at enhancing our understanding of ligand-dependent selectivity at human receptors. A GPCR system comprising the two neuropeptides oxytocin (OXT), arginine-vasopressin (AVP), and their corresponding receptors (OXTR, V1aR, V1bR, and V2R) served as a model to investigate receptor subtype selectivity and pathway specificity due to its high degree of homology and evolutionary conservation. We utilized novel oxytocin-like peptides identified by in silico genome mining and assessed their pharmacodynamic properties towards the human OXT/AVP receptors. Their ability to activate different G proteins and the two human beta-arrestins was measured using bioluminescence resonance energy transfer biosensors at V1aR, V1bR, and OXTR. Some peptide ligands displayed preferences for certain G protein or beta-arrestin pathways. Concentration-response measurements were carried out for a putative partial agonist, an antagonist, and a peptide with an inverse response relative to AVP at V1aR. A comparative sequence-activity analysis ultimately identified peptide residues that determine the observed activity patterns. The OXT/AVP system holds intriguing potential for research on selectivity in the intricate world of GPCRs. The outcomes of this work may thus contribute to an enhanced understanding of GPCR signaling and assist in the discovery of safer therapeutics with fewer off-target/off-pathway effects.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind für zahlreiche physiologische Prozesse von entscheidender Bedeutung und gelten daher als wichtige Ziele für therapeutische Wirkstoffe. Nach Stimulierung durch Liganden können sie verschiedene G-Proteine oder -Arrestine aktivieren. Die molekularen Mechanismen, die für die Aktivierung spezifischer GPCR-Subtypen und deren intrazelluläre Signalübertragung verantwortlich sind, blieben jedoch bisher unklar. GPCR-Liganden binden oft an mehrere Rezeptoren und induzieren verschiedene Reaktionswege, was die Entwicklung selektiver Medikamente erschwert. Diese Arbeit zielt daher darauf ab, unser Verständnis der Liganden-abhängigen Selektivität an menschlichen Rezeptoren zu verbessern. Ein GPCR-System, das die beiden Neuropeptide Oxytocin (OXT) und Arginin-Vasopressin (AVP) sowie die entsprechenden Rezeptoren (OXTR, V1aR, V1bR und V2R) umfasst, diente als Modell, um die Selektivität für Rezeptorsubtypen und Signalwege zu untersuchen, da es einen hohen Grad an Homologie und evolutionärer Konservierung aufweist. Wir verwendeten neuartige Oxytocin-ähnliche Peptide, die durch in silico genome mining identifiziert wurden, und untersuchten ihre pharmakodynamischen Eigenschaften an den menschlichen OXT/AVP-Rezeptoren. Ihre Fähigkeit, verschiedene G-Proteine und die beiden menschlichen beta-Arrestine zu aktivieren, wurde mit Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer-Biosensoren an V1aR, V1bR, und OXTR gemessen. Einige Liganden zeigten Präferenzen für bestimmte G-Protein- oder beta-Arrestin-Signalwege. Konzentrations-Wirkungs-Messungen wurden für einen mutmaßlichen partiellen Agonisten, einen Antagonisten und ein Peptid mit einem inversen Signal gegenüber AVP an V1aR durchgeführt. Durch eine vergleichende Sequenz-Aktivitäts-Analyse wurden schließlich Aminosäuren in den Peptiden identifiziert, die für die beobachteten Aktivitätsmuster verantwortlich sind. Das OXT/AVP-System birgt ein erstaunliches Potenzial für die Erforschung der Selektivität in der komplexen Welt der GPCRs. Die Ergebnisse dieser Arbeit können somit zu einem besseren Verständnis der GPCR-Signalübertragung beitragen und die Entdeckung von sichereren Therapeutika mit weniger Off-Target-/Off-Pathway-Effekten unterstützen.