Characterisation of the reconstitution and glycation process of collagen I

Abstract

Kollagen ist das am häufigsten vorkommende Protein im menschlichen Körper. Unter allen faserbildenden Kollagentypen ist Kollagen Typ I die am weitesten verbreitete Variante. Es wird am häufigsten in Bindegewebe, wie zum Beispiel Haut, Sehnen, Bändern, Blutgefäßen, Knorpelgewebe und den organischen Bestandteilen von Knochen und Zähnen vorgefunden.Durch Aggregation von Kollagenmolekülen entstehen Fibrillen. Kollagenmoleküle, meist aus Rattenschwanzsehnen oder Rinderhaut gewonnen und in Säure gelöst, können als Kollagenlösungen gekauft werden. Im Gegensatz zu nativen Kollagenfibrillen, die direkt aus dem Gewebe stammen, werden jene, die aus in Säure gelösten Kollagenmolekülen bestehen, als rekonstituiertes Kollagen bezeichnet.Die Quervernetzung einzelner Kollagenmoleküle kann entweder auf enzymatischer oder nicht-enzymatischer Basis erfolgen. Der Erhöhung der Gewebesteifigkeit aufgrund zunehmenden Alters und Diabetes lässt sich auf nicht-enzymatische Quervernetzung zurückführen. Diese wird durch die oxidative Reaktion zwischen hauptsächlich Glukose und Kollagenmolekülen gebildet, wodurch sogenannte fortgeschrittene Verzuckerungs-Endprodukte (AGE) entstehen. Ein hochreaktiver Vernetzer ist Methylglyoxal (MGO). In dieser Diplomarbeit wurde der, bedingt durch die Aggregation von Kollagenmolekülen zu Fibrillen, Anstieg der Trübung mit Hilfe eines Plattenlesegerätes untersucht. Durch das Ausschmieren auf Glasobjektträger wurden mehrere Proben, bestehend aus jeweils 15 ± 7 einzelnen Kollagenfibrillen, erstellt. An diesen wurden, unter Verwendung eines Rasterkraftmikroskops (AFM), Indentationsmessungen in trockener als auch wässriger (sowohl Phosphat-Pufferlösung PBS als auch MGO Puffer) Umgebung durchgeführt.Es wurde ein signifikanter Anstieg des über alle Fibrillen gemittelten Mittelwerts des Indentierungsmoduls pro Fibrille und über alle Messdurchgänge – sowohl zwischen den Gruppen PBS Puffer vor der Glykierung und MGO Puffer (p = 5,2834 ∙ 10E-15) als auch PBS Puffer vor und PBS Puffer nach der Glykierung (p = 1,2204 ∙ 10E-16) – beobachtet. Dieser mittlere Indentierungsmodul war während der Messungen in MGO Puffer um 1.17 MPa höher als während der Messungen in PBS Puffer vor der Glykierung. Dieser Unterschied betrug 1.20 MPa für die Messungen in PBS Puffer nach verglichen mit jenen in PBS Puffer vor der Glykierung. Da kein signifikanter Unterschied zwischen den Messungen in MGO Puffer und PBS Puffer nach der Glykierung festgestellt wurde, deutet dies darauf hin, dass kein messbarer Einfluss der Glykierung auf die Fibrillen, nachdem diese dem MGO Puffer ausgesetzt waren, vorhanden ist. Dieselbe Schlussfolgerung ergab sich auch auf Basis der gemittelten Medianwerte des Eindringmoduls pro Fibrille und über alle Messdurchgänge zwischen den zuvor beschriebenen Gruppen.

Collagen is the most abundant protein in the human body. Among all fibril-forming types of collagen, collagen type I is the most widely occurring one. It can primarily be found in structural tissues such as skin, tendons, ligaments, blood vessels, cartilage and in the organic parts of bones and teeth. Collagen molecules self-assemble into fibrils and can be bought as collagen solution in acid originating from different sources such as rat tail tendon or bovine skin. In contrast to native collagen fibrils, which come directly from tissue, the previously described collagen is referred to as reconstituted collagen.Individual collagen molecules can be crosslinked either via enzymatic or non enzymatic crosslinks. Tissue stiffening due to age and diabetes has been associated with non enzymatic crosslinks, formed due to oxidative reactions between mainly glucose and collagen molecules which lead to the formation of advanced glycation endproducts (AGEs). One potent cross linking agent is methylglyoxal (MGO).In this thesis the self-assembling process over time of reconstituted collagen fibrils was monitored, measuring the increase in turbidity employing a Plate Reader. After smearing out on glass slides, several samples, containing 15 ± 7 individual collagen fibrils each, were examined using an Atomic Force Microscope (AFM) for indentation experiments. They have taken place in dry or aqueous environment, one of which was represented by a PBS (phosphate-buffered saline) buffer and the other by an MGO buffer. A significant increase in the overall mean of the mean indentation moduli per individual fibril and over all measurement runs between both the groups PBS buffer before glycation and MGO buffer (p = 5.2834 ∙ 10E-15) and PBS buffer before and PBS buffer after glycation (p = 1.2204 ∙ 10E-16) was observed. Furthermore, when measured in in MGO buffer for glycation, this overall mean indentation modulus was 1.17 MPa higher compared to the measurements in PBS buffer before glycation. By comparison of the measurements in PBS buffer after glycation to the measurements in PBS buffer before glycation this difference was 1.20 MPa. No significant difference between the measurements in MGO buffer compared to the measurements in PBS buffer after glycation was observed, indicating no further influence of glycation after the exposure of the fibrils to the MGO buffer. The same conclusion was obtained by analysis of the overall mean of the median indentation moduli per individual fibril and over all measurement runs between the groups mentioned before.