Vibrational circular dichroism in the liquid phase – opportunities through mid-IR lasers

Abstract

Unter Chiralität versteht man die Unfähigkeit einer Verbindung, sich mit ihrem Spiegelbild zu überlagern. Diese Eigenschaft ist in der biochemischen Welt weit verbreitet, sie kommt sowohl in kleinen Molekülen als auch in den großen Strukturen von Enzymen und Rezeptoren vor. Aufgrund dieses breiten Vorkommens von Chiralität ist ein genaueres Verständnis der spezifischen Chiralität eines bestimmten Analyten in Bereichen wie der pharmazeutischen Produktion oder der Katalyse von entscheidender Bedeutung.Eine der vielseitigsten chiralen Analysemethoden ist Vibrationszirkulardichroismus (VCD), der auf dem Unterschied in der Absorption für links- und rechtsdrehend zirkular polarisiertes Licht beruht. Da die Technik im infraroten Spektralbereich arbeitet, ist sie für die Untersuchung organischer undanorganischer Moleküle vielseitig einsetzbar. VCD zeichnet sich jedoch auch durch eine geringe Signalintensität aus, die üblicherweise in der Größenordnung von 10-5 weniger im Vergleich zu seinem Gegenstück in der Absorption liegt. Daher erfordern typische Messungen mit Stand der Technik Fourier-transform infrared (FT-IR) Instrumenten Mittelungen über mehrere Stunden, um zufriedenstellende Signal-Rausch-Verhältnisse (SNR) zu erzielen, was ihre Anwendbarkeit auf sorgfältig kontrollierte End-of-the-Line-Experimente anstelle möglicher Monitoring-Anwendungen einschränkt.In dieser Arbeit wurde ein auf einem Quantenkaskadenlaser (QCL) basierendes VCD-System konstruiert, um die Herausforderungen von VCD-Messungen auszugleichen. QCLs sind leistungsstarke, durchstimmbare Laser im Infrarotbereich. Ihre inhärent polarisierte Emission eignet sich gut für VCD-Anwendungen. Das konstruierte System basierte auf einem „Balanceddetection“ Schema, dass das durch die Lichtquelle verursachtes Intensitätsrauschen kompensiert.Auf diese Weise war es erstmals möglich, eine bessere Leistung als Fourier-Transform-Infrarot (FTIR) VCD in Bezug auf SNR und Aufnahmezeit zu melden. Es konnten rauscharme VCD-Spektren bei Messzeiten von wenigen Minuten aufgenommen werden. Dies ermöglichte tatsächlich die Überwachung chiraler Veränderungen mit einer Zeitauflösung von weniger als 3 Minuten für kleine Moleküle in organischen Lösungsmitteln. Dezidierte Chemometrie wurde untersucht, um das Instrumentendesign als Sensoranwendung weiter voranzutreiben.QCL-VCD wurde außerdem eingesetzt, um die Sekundärstrukturanalyse von Proteinen in Lösungen zu untersuchen. Dafür wurde das System optimiert indem das Emissionsspektrum angepasst hat um die starke Absorption von H2O zu kompensieren. Daher konnte eine längere Schichtdicke (26 μm gegenüber 8 μm) verwendet werden und Konzentrationen bis hinunter zu 10 mg/mL waren messbar. Anschließend wurden noch niedriger konzentrierte Lösungen untersucht, indem von H2O auf D2O umgestellt hat und die Schichtdicke auf 204 μm erhöht wurde. Mit dem konstruierten QCL VCD-System war es möglich, niedrige Proteinkonzentrationen in D2O bis hinunter zu 2 mg/mL über den Amid-I- und Amid-II-Spektralbereich bei einer Messzeit von 1 Stunde zu messen. Da die meisten Strukturinformationen im Amid-I-Band enthalten sind, konnte der Laser so eingestellt werden, dass er nur diesen Bereich abdeckte. Dies ermöglichte Sekundärstrukturanalysen bei einer Messzeit von 5 Minuten. Dies ist eine erhebliche Verbesserung im Vergleich zur FT-IR-Messzeit für das äquivalente Rauschen, die 40 Minuten betrug. Dies bewies sowohl die Vielseitigkeit von QCL-VCD als auch die damit verbundenen potenziellen Anwendungsmöglichkeiten, die vom Sensordesign bis zur Bewertung der Proteinstruktur auf dynamischer Ebene reichen.

Chirality refers to the inability of a compound to be superimposed on its mirror structure. This characteristic is prevalent in the biochemical world, occurring both in small molecules as well as inthe large structures of enzymes and receptors. Due to this broad occurrence of chirality, a closer understanding of the specific chirality of a given analyte is essential in fields such as pharmaceutical production or catalysis. One of the most versatile chiral analytical methods is vibrational circular dichroism (VCD), which relies on the difference in absorbance for left and right-handed circular polarized light. Due to its operation in the infrared spectral region, it is broadly applicable for the study of organic and inorganic molecules. However, VCD is also characterized by its low signal intensity, commonly in the order of 10-5 less compared to its absorbance counterpart. As a result, typical measurements using state of the art Fourier-transform infrared (FT-IR) spectrometers require several hours of averaging to achieve satisfactory signal to noise ratios (SNR), limiting its applicability to carefully controlled end of the line experiments instead of possible monitoring applications. In this thesis a quantum cascade laser (QCL) based VCD system was constructed as a possible way to counteract the challenges of VCD measurements. QCLs constitute high power, tunable lasers inthe mid-infrared region. Their inherently polarized emission lends itself well to VCD applications.The constructed system was based on a balanced detection scheme, which compensates for the intensity noise introduced by the light source. In this way it was possible to report for the first time the outperformance of FT-IR-VCD in terms of SNR and acquisition time. It was possible to record low noise VCD spectra at measurement times of a few minutes. Indeed, this enabled monitoring of chiral changes at a time resolution below 3 minutes for small molecules in organic solvents. Dedicated chemometrics were explored to further advance the instrument design as sensorapplication.QCL-VCD was further employed to explore secondary structure evaluation of proteins in solution.For this, the system was optimized by tailoring the emission spectrum in order to compensate for the strong absorbance of H2O. Therefore a longer pathlength (26 μm vs 8 μm) could be used and concentrations down to 10 mg/mL were accessible. Following this, even lower concentrated solutions were investigated by switching from H2O to D2O and increase the pathlength to 204 μm.With the constructed QCL-VCD system it was possible to measure low concentrations of proteins in D2O down to 2 mg/mL over the amide I and amide II spectral range at 1 h measurement time. Since most of the structural information is contained in the amide I band, the laser could be set to onlycover this area. This enabled secondary structure evaluations at a measurement time of 5 minutes. This is a significant improvement compared to the FT-IR measurement time for the equivalent noise which was 40 min. This proved both the versatility of QCL-VCD and also the potential applications it enables, ranging from sensor design to protein structure evaluation at a dynamic level.