A comparison of known gene expressions on hydrogels of different stiffnesses using ADSCs and the investigation of SMARCE1A

Abstract

Mechanotransduktion beschreibt den Prozess, bei dem eine Zelle die Umgebungfühlen und auf diese reagieren kann. Wie dies genau funktioniert ist noch nicht geklärt,der Prozess ist aber während der Entwicklung eines Organismus essenziell. Dadie meisten Zellen adhärent sind, heften sie sich an eine extra zelluläre Matrix, die daher eine wichtige Rolle im Mechanotransduktionsprozess spielt. Zellen können Kräfte, die auf die Matrix wirken, sowie die Starrheit der Matrix, wahrnehmen und darauf reagieren, was zu einem ständigen Feedback führt. Die Steifigkeit dürfte einer der Hauptparameter bei der Steuerung verschiedener Zellfunktionen zu sein.Diese Arbeit konzentriert sich auf drei Proteine, die mechanoregulatorische Funktionenhaben, d. h. sie ändern ihre Expression mit einer sich ändernden Steifigkeit.Neben diesen Proteinen, LMNA/LMNB1, YAP1 und Paxillin, wurde ein viertes Protein, SMARCE1A, untersucht, dem zuvor keine mechanoregulatorischen Funktionen zugeordnet wurden. Um zu sehen, ob diese Proteine wirksame Mechanostatesind, wurden Zellen auf weichen bzw. steifen Substraten ausgesät, drei Tagelang gezüchtet, mit den Antikörpern der Proteine markiert und mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie analysiert.Wie zu erwarten, zeigten LMNA/LMNB1, YAP1 und Paxillin einen signifikanten Unterschied zwischen den Zellen die auf weichem Substrat gewachsen sind und jenen auf festen Substrat. Auch für SMARCE1A wurde ein signifikanter Unterschied festgestellt, jedoch geringer als bei LMNA/LMNB1 und YAP1. Der Vergleich dieser Proteine miteinander führt zu dem Ergebnis, dass YAP1 in diesem Experiment den größten Unterschied aufwies.Zusätzlich wurde für LMNA/LMNB1, YAP1 und Paxillin die Beziehung zwischen der Substratsteifigkeit und dem Zell- und Kernvolumen und -fläche berechnet.Diese Korrelationen zeigen, dass die Festigkeit einen deutlichen Einfluss auf die Zellgröße hat. Eine höhere Steifigkeit führt tendenziell zu einer größeren Fläche sowie zu einem größeren Volumen für die gesamte Zelle bzw. für den Zellkern.Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Steifigkeit der Umgebung einer Zelle einen großen Einfluss nicht nur auf die Morphologie, sondern auch auf die Zellfunktionen hat. Außerdem gibt es bestimmte Proteine, die mit der Festigkeit skalieren und daher als Referenz für die Steifigkeit der Umgebung verwendet werden können.

Mechanotransduction describes the process of a cell feeling and reacting to its environment.How this works exactly is not yet fully understood, however it is known to be important during an organisms development. As most cells are adherent,they attach to an extracellular matrix, which therefore plays an important role in the mechanotransduction process. Cells can sense forces actin on the extracellularmatrix as well as the matrix’ rigidity itself and further react to them, which leads to a constant feedback loop. The stiffness of the matrix seems to be one of the main parameters when it comes to controlling various cell functions.This work focuses on three proteins that have been shown to have mechanoregulatoryfunctions, meaning they change their expression with a changing matrixstiffness. Additionally to these proteins, namely LMNA/LMNB1, YAP1 and paxillin,a fourth protein, SMARCE1A, was investigated, which previously had not been linked to any mechanoregulatory functions. To see if these proteins were effective mechanostats, cells were seeded on soft and stiff substrates respectively,grown for three days, stained with the antibodies of the proteins in question and analysed using confocal fluorescent microscopy.As it was to be expected LMNA/LMNB1, YAP1 and paxillin all showed a significant difference when comparing the cells grown on a soft substrate to the ones onthe stiff substrates. For SMARCE1A also a significant difference was detected, it was however not as strong a difference as for LMNA/LMNB1 and YAP1. Comparing all these proteins with each other to conclude if there is one mechanostat that is better than the others leads to the result that in this experiment YAP1yielded the highest differences between soft and stiff substrates.Additionally, the relationship between the substrate stiffness and the cell and nuclearvolume and area was calculated for LMNA/LMNB1, YAP1 and paxillin.These correlations showed that the matrix’ stiffness has a clear impact on the cellsize. Higher rigidity tends to lead to higher area as well as higher volume for the entire cell and for the nucleus respectively.In conclusion, this work shows that the stiffness of a cell’s environment has a major impact not only on the morphology but also on cell functions. Further it shows that there are certain proteins which scale with the stiffness and can therefore be used as a reference point for the environments rigidity.